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葡萄冬剪枝条抗氧化特性及活性酚类成分的研究

作　者: 张昂
导　师: 王华
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 葡萄与葡萄酒学
关键词: 葡萄冬剪枝条抗氧化能力酚类化合物白藜芦醇互作效应
分类号: S663.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

葡萄冬剪枝条是一类源于葡萄种植业的固体废弃物，由于缺乏认识和相关研究，一直未能引起足够重视，目前大部分修剪物被就地焚烧或掩埋而易致环境污染，正确处置这一废弃物已成葡萄产业健康发展亟待解决之问题。本文首先调查了国内冬剪枝条的产量并分析了其基本理化特征，然后以巨峰、红地球、无核白、维多利亚、红玫瑰、赤霞珠、品丽珠、霞多丽、美乐及黑比诺等10个常见品种的冬剪枝条为对象，通过抗氧化检测方法的建立与优选，总多酚与活性单体的分析，单体的活性与构效关系，单体对总抗氧化活性的贡献及单体间的互作效应等方面系统深入地研究了冬剪枝条的抗氧化特性，以期为之合理开发利用提供理论支持，本研究获如下主要结论：（1）冬剪枝条的年单株产量在1.33³.21kg（鲜重），平均约2.35kg，鲜食品种和棚架栽培的株产分别高于酿酒和篱架，国内年产总量约3770kt，株产最高和最低的产区分别为黄河故道和甘宁产区，总产最高和最低的分别为新疆和东北产区。冬剪枝条呈酸性并富含有机质和钾、钙、磷、镁、铁、锰等多种元素，较皮渣，枝条中干物质、总有机碳、膳食纤维及锰含量较高。（2）新建了一种简捷、准确测试H₂O₂清除能力的抗氧化方法-钛盐比色（TSS）法。方法参数：H₂O₂浓度10mM，磷酸缓冲液60mM（pH7.4），硫酸钛50mM，硫酸1.2M；反应温度37°C；时间30min；终体积5.1mL；检测波长404nm。TSS法灵敏度高于直接清除法近23倍，同时精密度、重复性、准确度均优于直接清除法。（3）冬剪枝条提取物（VPE）在分属清除自由基、抗脂质过氧化、螯合金属离子及还原力4类机制的19种测试中均表现出不同程度的抗氧化作用，且在测试浓度范围内呈明显量效关系。不同品种的抗氧化力存在差异，其中部分差异显著，此外，品种间差异情况也受测试方法影响。10种被测VPE对DPPH、ABTS⁺、NO的平均清除能力均低于阳性对照Trolox，对HOCl、ONOO^-、O₂^-、 OH、H₂O₂的清除均高于Trolox，对ROO的清除与Trolox相当，对¹O₂^-的清除约为β-胡萝卜素的1/3；对磷脂酰胆碱过氧化的抑制力约为TBHQ的1/2；对Fe2+的螯合力约为EDTA的1/7；同时，VPE还具明显的还原特性。相同测试项目或目的的抗氧化指标间多呈极显著正相关，不同目的指标间的相关性呈多样化。遵循‘既要优先考虑具有生物相关性的方法，又要避免类似机理方法的重复而不失测试全面性，同时兼顾效率和成本’的原则，筛选ABTS（清除ABTS⁺）、PMS/NADH （O₂^-）、TBA（OH）)、 TSS （H₂O₂）、Crocin/ABAP（ROO）、RNO（1O₂^-）、TNB（HOCl）、EB（ONOO^-）、TBARS（抗脂质过氧化）、Ferrozine（螯合力）及CUPRAC（还原力）法等11种作为系统评价冬剪枝条抗氧化的方法体系。（4）建立了高效液相色谱（HPLC-UV）切换波长同时检测冬剪枝条中12种单体酚的方法，每种单体均在其最大吸收波长下得到检测。色谱条件：VP-ODS C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：3%乙酸和乙腈；梯度洗脱；波长模式：目标物信号响应前0.05min切至相应的最大吸收波长，响应结束后0.05min切至400nm；流速0.8mL/min；柱温30°C。较传统恒定波长（280nm）法，该法明显提高了多种酚类的检测灵敏度。（5）冬剪枝条多酚类物质含量丰富，且品种间存在差异。总酚、类黄酮、黄烷醇及羟基肉桂酸量最高为赤霞珠，而总原花青素最高的为黑比诺。12种单体在所有品种中均检出，含量最高为白藜芦醇、儿茶素及表儿茶素，平均分别占HPLC定量总和的33%、25%及25%。百克干重枝条含白藜芦醇138²91mg，较目前主要天然来源，冬剪枝条有望成为白藜芦醇新的最大潜在来源。冬剪枝条的酚类含量与抗氧化能力密切相关，且不同酚类组分或单体所起抗氧化作用存在差异。总酚与除螯合力外的其余抗氧化指标显著正相关；总类黄酮与部分自由基清除、抗脂质及还原能力显著正相关；总原花青素、总黄烷醇的相关性与类黄酮相似；总羟基肉桂酸仅与O₂^-和HOCl显著正相关。与抗氧化最相关的单体为儿茶素和表儿茶素，两者均与除ONOO^-外的大多数指标显著正相关，其次为白藜芦醇，与ROO、¹O₂^-、HOCl及抗脂质等显著正相关。（6）简单酚酸的抗氧化活性及构效关系受测试方法的影响较类黄酮大。在Crocin/ABAP法中，含连三酚羟基的简单酚酸的活性>邻二酚羟基>单羟基；酚羟基的甲氧基化削弱活性，而甲氧基数目的增加增强活性；相同芳香取代下，侧链为丙烯酸基团的酚酸的活性高于侧链为羧基的酚酸。在ABTS法中，酚羟基数目对肉桂酸衍生物的影响与ROO相反；甲氧基化及数目对除没食子酸外的其余酚酸的影响也与ROO相反。类黄酮在两种测试中的构效关系相似。B环含邻二酚羟基、C环具3位羟基、及C环存在共轭的C2-C3双键和4位羰基是确保类黄酮高活性的关键特征。（7）12种单体在Crocin/ABAP和ABTS法中的理论贡献之和分别占总活性的19.7⁵0.8%和34.1⁵7.9%，贡献最多的均为白藜芦醇、儿茶素及表儿茶素。不同酚类（原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、对香豆酸、白藜芦醇）等摩尔混合确存增效或拮抗作用，具体类型与组合中酚类种类、测试方法有关。Crocin/ABAP：原儿茶酸和表儿茶素对抗氧化活性主要起增效作用，而对香豆酸多显拮抗效应，白藜芦醇和儿茶素多呈加合效应。ABTS：白藜芦醇、儿茶素及表儿茶素对活性主要起增效作用，而对香豆酸和原儿茶酸多呈加合或拮抗效应。白藜芦醇/儿茶素/表儿茶素在两种测试中均表现为增效作用，结合这3种单体与抗氧化能力间的相关性及其对总活性的贡献，推断其为葡萄冬剪枝条中的主要活性单体。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-16
第一章文献综述  16-42
  1.1 中国葡萄产业概况  16-17
    1.1.1 葡萄种植规模及发展趋势  16
    1.1.2 葡萄栽培技术和品种  16-17
    1.1.3 葡萄产后加工  17
  1.2 葡萄生产加工中的废弃物  17-19
    1.2.1 气体废弃物  18
    1.2.2 液体废弃物  18-19
    1.2.3 固体废弃物  19
  1.3 固体葡萄废弃物的资源化研究概况  19-21
    1.3.1 原料化和材料化  20
    1.3.2 肥料化和基质化  20
    1.3.3 饲料化和能源化  20-21
  1.4 抗氧化与抗氧化检测方法的研究现状  21-34
    1.4.1 氧化与抗氧化  21-24
    1.4.2 抗氧化测定方法  24-32
    1.4.3 植物多酚  32-34
  1.5 固体葡萄废弃物抗氧化活性的研究现状  34-40
    1.5.1 固体葡萄废弃物抗氧化剂的提取方法  34-36
    1.5.2 固体葡萄废弃物抗氧化能力的测定方法  36-38
    1.5.3 固体葡萄废弃物抗氧化活性成分分析  38-40
  1.6 本研究简介  40-42
第二章葡萄冬剪枝条产量估算与基本理化成分分析  42-54
  2.1 材料与方法  42-45
    2.1.1 供试材料  42-43
    2.1.2 研究方法  43-45
    2.1.3 数据处理  45
  2.2 结果与讨论  45-52
    2.2.1 葡萄冬剪枝条产量调查与估算  45-47
    2.2.2 葡萄冬剪枝条与其它固体葡萄废弃物产量对比  47-48
    2.2.3 葡萄冬剪枝条基本理化成分分析  48-50
    2.2.4 葡萄冬剪枝条与其它固体葡萄废弃物成分对比  50-52
  2.3 小结  52-54
第三章葡萄冬剪枝条抗氧化能力的测评  54-88
  3.1 材料与方法  54-59
    3.1.1 供试材料  54-55
    3.1.2 研究方法  55-59
    3.1.3 数据处理  59
  3.2 结果与讨论  59-86
    3.2.1 不同抗氧化测试最佳检测波长的确定  59-61
    3.2.2 葡萄冬剪枝条清除人工合成自由基能力  61-65
    3.2.3 葡萄冬剪枝条清除活性氧能力  65-77
    3.2.4 葡萄冬剪枝条抗脂质过氧化能力  77-80
    3.2.5 葡萄冬剪枝条螯合金属离子能力  80-81
    3.2.6 葡萄冬剪枝条还原能力  81-83
    3.2.7 不同抗氧化指标间的相关性  83-86
  3.3 小结  86-88
第四章钛盐比色（TSS）法测定冬剪枝条清除过氧化氢的能力  88-100
  4.1 材料与方法  88-89
    4.1.1 供试材料  88-89
    4.1.2 研究方法  89
    4.1.3 数据处理  89
  4.2 结果与讨论  89-97
    4.2.1 TSS 法测试抗氧化的可行性及测试参数的确定  89-91
    4.2.2 TSS 测试的方法验证  91-93
    4.2.3 TSS 法测试葡萄冬剪枝条和标准物质清除 H_2O_2能力  93-95
    4.2.4 TSS 法与其它抗氧化测定方法的相关性  95
    4.2.5 不同抗氧化测试的方法学比较  95-97
  4.3 小结  97-100
第五章冬剪枝条中总多酚类物质的研究  100-112
  5.1 材料与方法  100-102
    5.1.1 供试材料  100
    5.1.2 研究方法  100-102
    5.1.3 数据处理  102
  5.2 结果与讨论  102-109
    5.2.1 葡萄冬剪枝条中的总酚含量  102-104
    5.2.2 葡萄冬剪枝条中的总类黄酮含量  104
    5.2.3 葡萄冬剪枝条中的总黄烷醇含量  104-105
    5.2.4 葡萄冬剪枝条中的总原花青素含量  105-107
    5.2.5 葡萄冬剪枝条中的总羟基肉桂酸含量  107-108
    5.2.6 多酚总量指标与抗氧化能力间的相关性  108-109
  5.3 小结  109-112
第六章高效液相色谱切换波长法检测冬剪枝条中的酚类单体  112-128
  6.1 材料与方法  112-113
    6.1.1 供试材料  112
    6.1.2 研究方法  112-113
    6.1.3 数据处理  113
  6.2 结果与讨论  113-125
    6.2.1 色谱条件的建立与优化  113-116
    6.2.2 定性实验  116-117
    6.2.3 分析方法的评价与验证  117-120
    6.2.4 葡萄冬剪枝条中酚类单体的含量  120-123
    6.2.5 葡萄冬剪枝条中酚类单体与抗氧化能力的相关性  123-125
  6.3 小结  125-128
第七章酚类单体的抗氧化能力及相关构效关系  128-138
  7.1 材料与方法  128-129
    7.1.1 供试材料  128
    7.1.2 研究方法  128-129
    7.1.3 数据处理  129
  7.2 结果与讨论  129-135
    7.2.1 不同酚类单体的结构  129-130
    7.2.2 简单酚酸的抗氧化能力及构效关系  130-133
    7.2.3 多酚类单体的抗氧化能力及构效关系  133-135
  7.3 小结  135-138
第八章酚类单体对总抗氧化能力的贡献及单体间的互作效应  138-152
  8.1 材料与方法  138-139
    8.1.1 供试材料  138
    8.1.2 研究方法  138-139
    8.1.3 数据处理  139
  8.2 结果与讨论  139-151
    8.2.1 不同酚类单体对总抗氧化能力的贡献  139-142
    8.2.2 不同酚类单体间的抗氧化互作效应  142-151
  8.3 小结  151-152
第九章结论  152-156
参考文献  156-170
缩略词  170-172
致谢  172-174
作者简介  174

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