学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMPK6a和GhMPK20的生物学功能分析

作　者: 李玉真
导　师: 郭兴启
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉花 GhMPK6a GhMPK20 功能分析
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 6次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

在植物长期进化过程中，MAPK信号级联途径（Mitogen-activated protein kinasepathway）在将细胞外信号刺激转导至细胞内从而引起相应的生理生化反应的过程中起着重要的枢纽作用。目前许多研究表明，MAPK级联信号途径广泛参与干旱、高盐等多种非生物胁迫及病原体侵染等生物胁迫信号途径，但目前大多数研究集中于拟南芥等模式生物中，对于经济作物棉花中的研究较少。另外，不同植物中的同源基因或者相同植物中同一家族的不同基因其生物学功能也具有一定的差异性。所以，借鉴已有的模式植物中相关同源基因的生物学功能研究，进而对重要的经济作物中相关基因的研究具有一定的必要性。棉花是世界性的纤维及油料作物，在我国是除粮食以外的重要经济作物之一，具有重要的经济价值。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）（鲁棉22）为研究材料，利用同源克隆的方法克隆获得两个MAPK基因，对其分别进行了序列分析、表达模式分析及生物学功能鉴定等，研究结果如下：（1）通过同源克隆的方法获得两个MAPK基因。通过基因全序列测定及进化树分析表明，同源克隆所获得基因分别为MAPK A亚组和D亚组基因，依据基因同源性将两基因分别命名为GhMPK6a和GhMPK20。亚细胞定位分析表明两者均定位于细胞质和细胞核中。因此推测两者可能在细胞质和细胞核中发挥相应的生物学功能。（2）对GhMPK6a和GhMPK20在棉花中的表达模式进行研究表明，GhMPK6a和GhMPK20的转录水平可受高盐、机械损伤、干旱和冷等非生物胁迫；脱落酸（Abacissicacid, ABA）、乙烯（Ethylene, ET）、茉莉酸（Jasmonate, JA）等多种信号分子及青枯细菌的诱导，说明两基因可能分别参与多种信号通路。（3）分别构建了两基因的正义植物表达载体，并通过农杆菌侵染的方法获得GhMPK6a和GhMPK20转基因本生烟植株，对两者的转基因本生烟植株进行生物学分析表明，转基因植株均对非生物胁迫干旱和高盐的敏感性增强。另外，GhMPK6a转基因植株对生物胁迫青枯细菌的侵染也表现一定的敏感性。通过IR-PCR的方法分别获得GhMPK6a和GhMPK20的启动子序列后，通过软件分析及GUS活性分析表明GhMPK6a与生长发育具有一定的相关性。GhMPK20的启动子序列分析及过表达GhMPK20的转基因植株的生长表型表明GhMPK20也与生长发育有关。（4）通过酵母双杂交的方法，证实所获得GhMKK4能够与GhMPK6a和GhMPK20互作。另外，通过双分子荧光互补实验进一步证实GhMKK4能够与GhMPK6a和GhMPK20在细胞质和细胞核中互作，说明GhMKK4为GhMPK6a和GhMPK20的上游激活基因。

全文目录

中文摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-23
  1.1 MAPK 级联信号途径  14-15
  1.2 植物中 MAPK 的结构特点和分类  15-17
  1.3 植物中 MAPK 级联信号途径的作用  17-22
    1.3.1 植物中 MAPK 级联信号途径与非生物胁迫  18-19
    1.3.2 植物中 MAPK 级联信号途径与生物胁迫  19-21
    1.3.3 植物中 MAPK 级联信号途径与生长发育  21-22
  1.4 本研究的目的及意义  22-23
2 材料与方法  23-37
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 植物材料  23
    2.1.2 菌株与质粒  23
    2.1.3 酶与各种生化试剂  23
    2.1.4 序列测定  23
    2.1.5 引物  23-25
  2.2 实验方法  25-37
    2.2.1 棉花幼苗的培养与处理  25-26
    2.2.2 植物总 RNA 的提取  26-27
      2.2.2.1 利用 Trizol Kit 提取总 RNA  26
      2.2.2.2 利用 CTAB 法提取总 RNA  26-27
    2.2.3 cDNA 第一链的合成  27
    2.2.4 cDNA 纯化（用于 5' RACE）  27
    2.2.5 cDNA 的末端加尾反应（用于 5' RACE）  27-28
    2.2.6 PCR 扩增片段的回收  28
    2.2.7 目的片段与克隆载体的连接  28-29
    2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  29
      2.2.8.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  29
      2.2.8.2 大肠杆菌感受态细胞的转化  29
    2.2.9 试剂盒法质粒微量提取方案  29-30
    2.2.10 重组质粒的酶切鉴定  30
    2.2.11 cDNA 全长序列的获得  30-31
      2.2.11.1 利用简并引物进行 PCR 扩增以获得中间片段  30-31
      2.2.11.2 5' RACE 和 3' RACE  31
      2.2.11.3 cDNA 全长序列的获得  31
    2.2.12 植物基因组 DNA 的提取  31-32
      2.2.12.1 CTAB 法提取基因组 DNA  31-32
      2.2.12.2 植物基因组 DNA 的纯化  32
      2.2.12.3 小量法提取基因组 DNA  32
    2.2.13 全长基因组序列的获得  32-33
    2.2.14 基因枪瞬时转化  33-34
      2.2.14.1 目的基因融合 GFP 表达载体制备  33
      2.2.14.2 基因枪微弹的准备  33
      2.2.14.3 基因枪转化  33-34
    2.2.15 植物表达载体的构建与转化  34-36
      2.2.15.1 农杆菌感受态细胞的制备  34-35
      2.2.15.2 植物表达载体的构建及农杆菌感受态细胞的转化  35
      2.2.15.3 农杆菌介导转化烟草  35-36
    2.2.16 转基因植物 GUS 组织化学染色分析  36
    2.2.17 酵母双杂交和双分子荧光互补实验  36-37
3 结果与分析  37-70
  3.1 棉花 GhMPK6a 基因的分离及序列分析  37-42
    3.1.1 GhMPK6a 中间片段的分离  37
    3.1.2 GhMPK6a 5'片段及 3'片段的分离  37-38
    3.1.3 GhMPK6a 全长 cDNA 及 DNA 序列的分离  38-39
    3.1.4 GhMPK6a 启动子序列的分离  39-40
    3.1.5 GhMPK6a cDNA 及 DNA 序列分析  40
    3.1.6 GhMPK6a 编码蛋白序列分析  40-42
  3.2 棉花 GhMPK6a 基因的相关生物学功能分析  42-57
    3.2.1 GhMPK6a 的亚细胞定位分析  42-43
    3.2.2 GhMPK6a 的表达模式分析  43-44
    3.2.3 GhMPK6a 基因超表达转基因本生烟的获取  44-46
      3.2.3.1 GhMPK6a 基因正义表达载体的构建  45
      3.2.3.2 超表达 GhMPK6a 本生烟的获得  45-46
    3.2.4 GhMPK6a 转基因本生烟的生物学功能分析  46-57
      3.2.4.1 GhMPK6a 转基因本生烟对甘露醇引起的渗透胁迫的敏感性  46-47
      3.2.4.2 GhMPK6a 转基因本生烟幼苗对干旱胁迫的敏感性  47-48
      3.2.4.3 GhMPK6a 转基因植株在干旱胁迫后与氧化系统的关系  48-50
      3.2.4.4 GhMPK6a 转基因植株对高盐胁迫的敏感性  50-51
      3.2.4.5 GhMPK6a 转基因植株系对 ABA 的敏感性  51-52
      3.2.4.6 GhMPK6a 转基因植株系对青枯细菌侵染的敏感性  52-53
      3.2.4.7 GhMPK6a 启动子分析  53-55
      3.2.4.8 GhMPK6a 与 GhMKK4、GhMKK5 互作关系  55-57
  3.3 棉花 GhMPK20 基因的分离及序列分析  57-61
    3.3.1 GhMPK20 全长 cDNA 序列的分离  57-58
    3.3.2 GhMPK20 基因组及启动子序列的分离  58-59
    3.3.3 GhMPK20 编码氨基酸序列分析  59-61
  3.4 棉花 GhMPK20 基因的相关生物学功能分析  61-70
    3.4.1 GhMPK20 的表达模式分析  61-62
    3.4.2 GhMPK20 的亚细胞定位分析  62-63
    3.4.3 GhMPK20 基因超表达转基因本生烟的获取  63
    3.4.4 GhMPK20 转基因本生烟的生物学功能分析  63-70
      3.4.4.1 GhMPK20 转基因本生烟对干旱的敏感性  63-64
      3.4.4.2 GhMPK20 转基因本生烟在干旱胁迫后与氧化系统的关系  64-66
      3.4.4.3 GhMPK20 转基因本生烟对高盐胁迫的敏感性  66-67
      3.4.4.4 GhMPK20 转基因本生烟萌发后对甘露醇、NaCl 及 ABA 信号分子的敏感性  67
      3.4.4.5 GhMPK20 启动子分析  67-69
      3.4.4.6 GhMPK20 与 GhMKK4、GhMKK5 互作关系  69-70
4 讨论  70-75
5 结论  75-76
参考文献  76-81
致谢  81-82
攻读学位期间发表论文情况  82

棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMPK6a和GhMPK20的生物学功能分析

内容摘要

全文目录

相似论文