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水稻抗白叶枯病相关基因的转基因研究及新型转基因标签的开发

作　者: 陈娟
导　师: 严成其
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻白l叶枯病菌白叶枯病抗病性农杆菌介导的转化 HPT-mCherry融合标签
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌引起的细菌性病害,严重影响水稻的产量。目前,培育抗病品种是抵抗白叶枯病菌侵染的最经济有效的措施。然而,白叶枯病菌容易产生致病性的分化,因此,培育抗病品种不是一劳永逸的,需要不断的利用基因轮换和多基因聚合等技术,以获得广谱并且具有持久抗性的品种。本实验室前期通过体细胞不对称杂交技术,获得了高抗白叶枯病菌的品种Y73。通过优化AAM悬浮培养基配方和调整农杆菌侵染温度,将Y73的转基因效率提高至66.5%,并利用农杆菌侵染实验,初步探索了Y73中农杆菌侵染相关基因的表达模式。另外,在分析芯片数据后发现,一个NBS-LRR类基因的表达量在接种白叶枯病菌PXO341后明显上调。利用分子克隆技术,克隆得到该基因,通过序列比对,发现其序列与玉米Rpl的序列具有较高的相似性,因此命名为OsRP1L1(Oryza sativa Rp1-like1)基因,RAP-DB (Rice Annotation Project Database)数据显示该基因编码RPP13类似蛋白。本研究针对OsRP1L1展开了一系列的工作,对该基因的功能进行了分析,并已取得以下结果：1.利用农杆菌介导的转基因技术获得OsRP1L1超表达的转基因植株。通过PCR鉴定和卡方分析,确认了三个单插入位点的纯合体超表达株系。连续的观察和检测显示,该基因的超表达可在后代中稳定遗传。2.构建了双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)相关载体,并在烟草瞬时表达系统中对该基因的互作进行了初步的研究。结果显示,该基因没有明显的自身互作现象。目前我们已经构建了酵母双杂交(yeast two-hybrid system, Y2H)载体,并开展了相关的筛选工作,以期筛选与其互作的蛋白。3.激素和环境胁迫处理显示,在JA、SA、高盐和高温处理石狩白毛(Oryza sativa L. ssp. Japonica cv. Ishikari-shiroge, I-S)后,OsRP1L1表达量下降,2,4-D处理后OsRP1L1的表达量上调,说明该基因响应多种激素和非生物胁迫处理。芯片数据结果分析显示,与对照相比,OsRP1L1(?)表达材料中有26个基因的表达差异大于2倍,其中有25个基因的表达上调,1基因的表达下调。查阅相关资料后发现,有7个基因同时也受OsbZIP46的调控。这些结果表明该基因在水稻抗病抗逆境途径中具有潜在的信号传导功能。4.通过抗谱分析,我们发现该基因的超表达材料对部分生理小种的抗病性有所改变。5.构建了OsRP1L1-sGFP融合表达载体,利用农杆菌介导的转化技术获得了相应的转基因植株。采用振动切片技术及激光共聚焦显微观察,发现绿色荧光主要集中于细胞核中,推测OsRP1L1编码蛋白定位于细胞核中。此外,为加速相关转基因操作中鉴定的效率,开发了HPT-mCherry融合标签,研究成果如下：1.利用融合PCR技术和分子生物学实验,成功构建了包含HPT-mCherry融合标签的转基因载体。2.通过转基因实验,确认了融合标签既能有效筛选转基因材料,加速了转基因鉴定的效率。3.PCR鉴定转基因植株的结果与荧光显微镜观察mCherry红色荧光的结果一致。绝对定量PCR实验表明,HPT-mCherry能在转基因愈伤和植株高效表达。从而证明,该载体能够有效提高转基因材料鉴定的效率和准确率。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-13
缩略词表  13-14
第1章文献综述  14-26
  1.1 水稻白叶枯病  14-15
  1.2 水稻白叶枯病抗病基因研究  15-17
  1.3 植物抗病机制  17-20
    1.3.1 植物过敏反应  18-19
    1.3.2 系统获得抗性  19-20
  1.4 激素  20-23
    1.4.1 SA介导的抗病途径  20-21
    1.4.2 JA和ET介导的抗病途径  21-22
    1.4.3 其他激素介导的抗病途径  22-23
  1.5 mCherry可视化标签的筛选  23-24
  1.6 研究目的及意义  24-26
第2章农杆菌介导的Y73转化体系的优化  26-34
  2.1 实验材料  26
  2.2 实验方法  26-29
    2.2.1 农杆菌介导的水稻转基因过程  26-27
    2.2.2 水稻Y73材料RNA的提取及反转录  27
    2.2.3 Y73转基因体系的优化及定量PCR分析  27-29
  2.3 实验结果  29-32
    2.3.1 Y73和大粒香转基因效率比较分析  29-30
    2.3.2 Y73转基因体系的优化  30-31
    2.3.3 Y73中OsMPKs,OsVIP1s和OsPR1s基因在不同共培养温度下的表达差异  31-32
  2.4 分析与讨论  32-34
第3章 OsRP1L1超表达纯合体的获得及抗性分析  34-50
  3.1 实验材料与试剂  34
  3.2 实验方法  34-41
    3.2.1 种子的萌发与破休眠  34-35
    3.2.2 提取植物基因组DNA并鉴定  35
    3.2.3 半定量与定量PCR  35-36
    3.2.4 凝胶切片与共聚焦观察  36
    3.2.5 BiFC相关载体构建  36-37
    3.2.6 烟草瞬时表达  37-38
    3.2.7 白叶枯病抗性分析  38
    3.2.8 激素处理与环境胁迫  38-39
    3.2.9 目的蛋白诱导表达  39
    3.2.10 SDS-PAGE胶系统的制备与染色  39-40
    3.2.11 芯片分析  40-41
  3.3 实验结果  41-48
    3.3.1 超表达纯合体材料的获得及表型观察  41-42
    3.3.2 转基因材料的鉴定  42-43
    3.3.3 激素处理与环境胁迫  43-44
    3.3.4 OsRP1L1编码蛋白的定位  44-45
    3.3.5 抗性分析  45-46
    3.3.6 基因表达分析  46-47
    3.3.7 蛋白互作  47
    3.3.8 蛋白表达检测  47-48
  3.4 讨论  48-50
第4章 HPT-mCherry融合标签的开发  50-56
  4.1 实验材料与试剂  50
  4.2 实验方法  50-51
    4.2.1 载体构建  50-51
    4.2.2 转基因材料的鉴定  51
    4.2.3 转基因水稻荧光检测  51
    4.2.4 标准曲线的建立及qRT-PCR  51
  4.3 结果与分析  51-55
    4.3.1 利用融合标签有效筛选阳性愈伤  51-52
    4.3.2 利用融合标签鉴定转基因植株  52-54
    4.3.3 HPT和mCherry基因在mRNA水平上的表达分析  54-55
  4.4 讨论  55-56
第5章结论与展望  56-58
  5.1 主要结论  56
  5.2 创新之处  56
  5.3 展望  56-58
参考文献  58-70
附录  70-76
致谢  76-77
攻读学位期间取得的研究成果  77-78

水稻抗白叶枯病相关基因的转基因研究及新型转基因标签的开发

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