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柑橘溃疡病菌致病性影响因素的研究

作　者: 刘利平
导　师: 邓子牛
学　校: 湖南农业大学
专　业: 园艺学
关键词: 柑橘溃疡病病原菌致病性侵染力寄主环境 GFP标记 GntR转录因子
分类号: S436.661
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

柑橘溃疡病(Xanthomonas axonopdis pv. citri)是世界性的检疫性病害,为柑橘最重要的病害之一,已对多数柑橘主产国造成严重危害。湖南是中国主要的柑橘产区之一,全省推广的冰糖橙和脐橙等主栽甜橙品种受溃疡病的危害尤为严重。国内外对柑橘溃疡病的研究已开展了大量工作,但是溃疡病的致病机理尚不清楚,因此田间的防控效果不理想。因此,本研究从病原、寄主和环境三方面进行多因素的全面分析,探讨影响溃疡病菌在不同品种上侵染力差异的各项因素,同时开展致病相关因子的研究,以期对溃疡病的田间防治提供指导,对溃疡病菌与寄主互作及致病机理的研究提供理论基础。本文从病原和寄主的生物学特性与侵染力的关系分析到转录因子对病原菌致病性调控进行了较为系统的研究,基本达到了预期的研究目标,其主要研究结果如下：1.溃疡病菌在离体培养条件下培养12-18h时致病力最强,培养60h以后致病力明显下降。浓度是决定发病速度和程度的关键,在寄主器官没有伤口时,需要高浓度(108CFU/ml及以上)的足量病原菌(人工接种5μL)才能引起典型的溃疡病症状,并且浓度越高,发病越快。寄主受机械损伤有利于病原菌的侵染,注射接种或者通过针刺、摩擦等方法给寄主造成创伤后接种,只需102CFU/ml浓度的溃疡病菌就足以引发病害。因此,病原菌本身的生长发育状态,以及接触到寄主表面时的病原浓度是决定溃疡病菌在寄主上侵染程度的关键因子,而机械损伤则有利于增加溃疡病菌在寄主上侵染的严重性。2.采用多种接种方法接种不同柑橘种类品种叶片,冰糖橙、脐橙等甜橙品种最易感病,田间较少感病的温州蜜柑等宽皮柑橘人工接种时还是会表现典型的溃疡病症状,田间一般不感病的金柑,接种后仍不易感病,抗病的枸橼C-05在接种后,接种处全部出现褐化死亡的过敏反应,表现出主动抗病。所以,品种感病性差异与自身的遗传因素相关。3.在温室条件下,采用108CFU/ml的溃疡病菌进行喷雾接种,冰糖橙新抽生而未展开的叶片感病率较低；展开达到最大叶面积1/4的叶片和1/2的叶片感病最为严重；完全展开达到最大叶面积但未转绿的叶片也有发病,且发病率较低；完全展开达到最大叶面积且已转绿的叶片几乎没有病斑产生。而抗病的枸橼C-05仅在处于幼嫩阶段的新叶上出现少数褐化死亡的斑点,所有的叶片均无典型溃疡病斑产生。该结果说明抗病品种的抗病性不受组织器官的发育阶段影响,而溃疡病在感病品种上的侵染力差异受叶龄影响。4.冰糖橙、纽荷尔脐橙、糖橙、宫本温州蜜柑、浏阳金柑和枸橼C-05等6个柑橘属种类品种中,以浏阳金柑气孔密度最小,为353.85个/mm2,其它5个感病性差异较大的种类品种气孔密度在515-551个/mm2之间,无显著差异,且在相同环境条件下,品种之间的气孔开张度也没有显著差异。因此,品种间的气孔的密度和开张度与品种感病性的差异没有必然的联系。5.在叶面不受伤时,喷雾接种108CFU/ml的溃疡病菌后,扫描电镜和EGFP标记菌示踪均观察到溃疡病菌在感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05叶面均能生长,菌体在叶面随机分布,没有气孔趋向性,没有识别气孔的能力。因此,根据以上结果认为柑橘气孔的形态特征和开闭特性不宜作为评价寄主对溃疡病的感病性或抗病性的指标。6.喷雾接种EGFP标记病原菌后,在激光共聚焦显微镜下观察到溃疡病菌在冰糖橙和枸橼叶面均能正常生长,其分布与扫描电镜所观察到的结果一致：但是,通过注谢和针刺接种EGFP标记菌时,在激光共聚焦显微镜下观察到溃疡病菌在冰糖橙叶片的叶肉组织增殖迅速,很快引发病害,而在枸橼C-05的叶肉组织中,溃疡病菌的生长受到抑制,最终未能诱发病症。结合其他接种结果分析,说明溃疡病菌的侵染确实没有气孔偏好性,且枸橼C-05在叶表面没有阻止细菌进入的物理障碍,而是在细菌进入叶肉组织后抑制其进一步的繁衍定殖。7.根据气象因素与发病规律的分析,病害发生前均需要雨水,平均气温接近20℃时,春梢与夏秋梢一样发病,在发病期间,一直都伴随着不同大小的刮风天气。因此,水和温度是柑橘溃疡病发生的必要条件,风则是加重病害发生的辅助条件。所以,当温度即回升至20℃时,在降雨之前必须进行药剂喷施以预防柑橘溃疡病。8.根据已公布的柑橘溃疡病菌基因组序列的信息,通过生物学相关软件进行分析,发现柑橘溃疡病菌基因组中的7个GntR转录因子,分属4类亚家族,其中有2个(XAC-0568和XAC0877)属于FadR亚家族,3个(XAC0711.XAC1640和XAC3532)属于HutC亚家族；1个(XAC0737)属于MocR亚家族,1个(XAC1548)属于YtrA亚家族。通过对同源基因的分析,发现转录因子XAC1548与十字花科中的转录调控因子XC2736相似率高达98%,该因子证实参与了致病性调控；同时,在XAC1548基因上游启动子序列有一个不严谨的与致病相关的植物诱导启动子(PIP box),这一切表明,XAC1548可能参与了溃疡病的致病性调控。9.将柑橘溃疡病菌GntR基因家族的XA C1548命名为gntR1Xac,且成功构建了gntR1Xac基因敲除载体,获得了gntR1Xac缺失的溃疡病菌,活体接种试验表明缺失突变体丧失了在感病泳糖橙上的致病性,这意味着XAC1548转录因子在溃疡病的致病过程中参与了调控作用。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
缩略词表  11-17
第一章前言  17-35
  1.1 问题的提出  17-18
  1.2 柑橘溃疡病研究进展  18-27
    1.2.1 柑橘溃疡病菌菌系的分类与命名  18-21
    1.2.2 柑橘溃疡病的分布  21-22
    1.2.3 柑橘溃疡病的发生、危害和传播  22-24
      1.2.3.1 柑橘溃疡病发病的温光条件  22
      1.2.3.2 柑橘溃疡病的危害和传播  22-24
    1.2.4 柑橘溃疡病菌的分离和鉴定  24-25
    1.2.5 柑橘溃疡病的防治  25
    1.2.6 柑橘品种的感病性评价  25-26
    1.2.7 植物形态结构与感病性的关系  26-27
  1.3 GFP在监测细菌病原菌入侵寄主中的应用  27-30
    1.3.1 GFP的理化性质和荧光原理  28
    1.3.2 GFP在病原菌入侵寄主过程中的示踪作用  28-30
  1.4 柑橘溃疡病菌致病因子的研究进展  30-33
    1.4.1 溃疡病菌致病基因的克隆鉴定  30-31
    1.4.2 GntR家族转录因子的结构和调控特征  31-32
    1.4.3 GntR家族转录因子的主要功能  32-33
  1.5 本研究目的目的和意义  33-35
第二章溃疡病菌的分离及其生物学特征分析  35-51
  2.1 引言  35
  2.2 材料和方法  35-40
    2.2.1 病斑的选择及病菌的洗脱分离  35-36
    2.2.2 分离菌的培养  36
    2.2.3 PCR鉴定  36-37
    2.2.4 分离菌株的致病性鉴定  37-38
    2.2.5 Xac 16S rRNA检测  38
      2.2.5.1 16 sRNA基因的PCR扩增  38
      2.2.5.2 16 srRNA基因的克隆测序  38
    2.2.6 分离菌株生理生化特性的测定  38
    2.2.7 分离菌株生长曲线的绘制  38-39
    2.2.8 分离菌株不同培养时间致病力分析  39
    2.2.9 不同浓度的分离菌株的致病力分析  39-40
  2.3 结果与分析  40-48
    2.3.1 病原菌的分离  40-41
    2.3.2 分离菌株的PCR分析和致病力鉴定  41-42
    2.3.3 生理生化指标分析  42-43
    2.3.4 16S rRNA分析  43-45
    2.3.5 溃疡病菌生长动力学分析  45
    2.3.6 病原菌生长期与致病性关系  45-47
    2.3.7 不同溃疡病菌的接种浓度对冰糖橙溃疡病发生的影响  47-48
  2.4 讨论  48-51
第三章寄主感病性影响因素的分析  51-68
  3.1 引言  51
  3.2 材料和方法  51-55
    3.2.1 柑橘种类品种的感病性评价  51-52
    3.2.2 冰糖橙叶片发育阶段与感病性的关系  52-53
    3.2.3 气孔器特征与感病性关系  53-54
      3.2.3.1 气孔密度观察  53
      3.2.3.2 气孔形态观察  53
      3.2.3.3 气孔开度观察  53-54
    3.2.4 叶片组织结构与感病性关系  54
      3.2.4.1 叶片组织结构观察  54
      3.2.4.2 叶片蜡质含量的测定  54
    3.2.5 接种溃疡病菌后寄主叶面的扫描电镜观察  54
    3.2.6 环境因素与感病性的关系  54-55
  3.3 结果与分析  55-66
    3.3.1 寄主品种的感病性评价  55-56
    3.3.2 冰糖橙新叶不同发育阶段的感病性观察  56-58
    3.3.3 气孔器特征与感病性的关系  58-60
    3.3.4 不同环境条件下气孔的开闭  60-61
    3.3.5 叶片组织结构与感病性的关系  61-62
    3.3.6 接种后冰糖橙与枸橼的电镜观察  62-64
    3.3.7 环境因子对溃疡病发生的影响  64-66
  3.4 讨论  66-68
第四章利用EGFP标记溃疡病菌观察侵染过程  68-91
  4.1 引言  68
  4.2 材料方法  68-75
    4.2.1 EGFP质粒和工程菌  68-69
    4.2.2 质粒的纯化与鉴定  69-72
      4.2.2.1 质粒提取  69
      4.2.2.2 质粒中基因的酶切鉴定  69-70
      4.2.2.3 egfp基因的克隆测序  70-72
    4.2.3 利用EGFP标记溃疡病菌  72-74
      4.2.3.1 三亲本杂交  72-73
      4.2.3.2 转化子的筛选和PCR鉴定  73
      4.2.3.3 EGFP标记溃疡病菌的致病性鉴定  73
      4.2.3.4 转化溃疡病菌的生长动力学分析及在寄主体内生长  73-74
    4.2.4 EGFP标记溃疡病菌示踪侵染寄主的过程  74-75
      4.2.4.1 利用EGFP标记溃疡病菌观察柑橘品种的感病性  74
      4.2.4.2 溃疡病菌在叶面生长观察  74
      4.2.4.3 柑橘溃疡病菌在叶肉间隙生长观察  74
      4.2.4.4 利用EGFP标记菌观察菌液浓度和叶片创伤对病原侵染力的影响  74-75
  4.3 结果和分析  75-89
    4.3.1 菌种活化及鉴定  75-76
    4.3.2 转化子的筛选及其PCR鉴定  76-79
    4.3.3 EGFP标记溃疡病菌的生长动力学分析和致病性鉴定  79-81
    4.3.4 利用EGFP标记溃疡病菌观察不同柑橘种类品种的感病性  81-84
    4.3.5 利用EGFP标记溃疡病观察其在柑橘叶面的生长情况  84-86
    4.3.6 利用EGFP标记溃疡病观察其在柑橘叶肉间隙的生长情况  86-88
    4.3.7 利用EGFP标记溃疡病菌观察侵染过程  88-89
  4.4 讨论  89-91
第五章柑橘溃疡病菌GNTR家族转录因子的生物信息学分析  91-104
  5.1 引言  91
  5.2 材料和方法  91-93
    5.2.1 GntR家族转录因子基因的查询和分类  91
    5.2.2 多序列比对和进化树构建  91-92
    5.2.3 二级结构预测  92
    5.2.4 同源建模和模型评估  92
    5.2.5 结合位点预测  92
    5.2.6 Reciprocal BLAST  92-93
  5.3 结果与分析  93-103
    5.3.1 Xac GntR转录调节因子一级结构分析  93-94
    5.3.2 Xac GntR转录调节因子二级结构分析  94-97
    5.3.3 Xac GntR转录调节因子空间结构预测  97-102
    5.3.4 黄单胞杆菌属中的直向同源基因的预测  102-103
  5.4 讨论  103-104
第六章 GNTR1_(XAC)基因的致病功能鉴定  104-113
  6.1 引言  104
  6.2 材料和方法  104-107
    6.2.1 质粒、菌株和引物设计  104-106
    6.2.2 制备大肠杆菌S17-1化学转化感受态细胞  106-107
    6.2.3 大肠杆菌S17-1感受态细胞的化学转化  107
    6.2.4 gntR1_(Xac)基因敲除突变菌株的致病性鉴定  107
  6.3 结果与分析  107-112
    6.3.1 gntR1_(Xac)生物信息学分析  107-108
    6.3.2 gntR1_(Xac)基因敲除载体的构建  108-109
    6.3.3 gntR1Xac基因的无痕敲除  109-110
    6.3.4 敲除gntR1_(Xac)基因后的PCR检测  110-111
    6.3.5 gntR1_(Xac)基因突变菌株的致病性鉴定  111-112
  6.4 讨论  112-113
全文结论  113-115
论文创新点  115-116
下一步工作设想  116-117
参考文献  117-128
附录  128-131
  附录A 质粒pMP2463构建图  128-129
  附录B 提交到GenBank的Xac DL509的16S rRNA序列  129-131
致谢  131-132
作者简介  132-133

柑橘溃疡病菌致病性影响因素的研究

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