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一株杀线虫苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及其ICPs基因的克隆

作　者: 王忠勇
导　师: 张德咏
学　校: 湖南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 植物寄生线虫 苏云金芽胞杆菌 分离纯化 伴胞晶体蛋白 cry基因 基因克隆
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究选用苏云金芽胞杆菌YC-10(Bacillus thuringiensis, Bt)为实验对象,对该菌株进行了分离鉴定及对其发酵条件和培养基组分进行了筛选研究,并从苏云金芽胞杆菌菌株中克隆了控制伴胞晶体蛋白合成的cry基因,进一步对其进行原核表达,构建了cry-pQE30重组表达质粒,为该基因的原核表达乃至研制杀线虫生防药剂打下基础。主要结果如下：1、对来自烟草的产芽胞杆状细菌进行了分离纯化,并对其进行了鉴定。16SrRNA结果表明该产芽胞杆状细菌属于芽胞杆菌属,对比该细菌与两株苏云金芽胞杆菌标准菌株的生理生化特性,证明该产芽胞杆状细菌为苏云金芽胞杆菌,命名为YC-10。2、在证明该细菌为苏云金芽胞杆菌的基础上,利用正交试验设计和响应面设计对苏云金芽胞杆菌YC-10的摇瓶发酵条件和培养基成分进行了筛选。优化后得知其摇瓶发酵条件为：初始摇瓶发酵培养基体积为60ml/500ml,初始培养基pH值为8.0,4%接种量,37℃条件下,200r/min培养40h,其芽胞产量达到了7.85×108个/ml。在优化培养条件的基础上进一步对其培养基成分进行筛选,筛选后培养基组分由原来的8种减少为4种,芽胞产量提高到10.5×108个/ml。3、对苏云金芽胞杆菌YC-10的伴胞晶体蛋白进行了蛋白质变性电泳,发现其蛋白质大小在50KDa左右。室内测定了YC-10的伴胞晶体蛋白对南方根结线虫的毒力。结果表明,伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2具有较强的杀灭活性,96h对南方根结线虫的LC50为4.262mg/L。表明该菌株在防治植物线虫病害上具有巨大的潜力。4、利用PCR对伴胞晶体蛋白的合成基因(cry基因)进行了克隆并使用TAIL-PCR技术以总DNA为模板进行了cry基因的全长基因获得,随后对其进行了原核表达,为获得高效表达伴胞晶体蛋白的工程菌打下基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章 文献综述  11-21
  1 植物线虫和植物寄生线虫防治  11-17
    1.1 植物寄生线虫概述  11
    1.2 植物寄生线虫的发现及其病害  11-12
    1.3 植物寄生线虫病的防治  12-13
      1.3.1 物理、农业防治  12
      1.3.2 选用抗性品种  12-13
      1.3.3 化学防治  13
    1.4 植物寄生线虫病的生物防治  13-17
      1.4.1 杀线虫真菌  13-14
        1.4.1.1 杀线虫真菌的分类  13-14
      1.4.2 生防细菌  14-16
        1.4.2.1 杀线虫细菌种类  14-15
        1.4.2.2 寄生细菌—巴氏杆菌(Pasteruria spp.)  15
        1.4.2.3 根际细菌  15-16
        1.4.2.4 其他杀线虫细菌  16
      1.4.3 杀线虫放线菌  16-17
  2 苏云金芽胞杆菌及杀线虫晶体蛋白  17-20
    2.1 杀线虫Bt菌株的发现  17
    2.2 杀线虫Bt的活性成分及其作用机理  17-19
      2.2.1 苏云金芽胞杆菌的活性成分  17-19
        2.2.1.1 伴胞晶体蛋白(ICPs)  18-19
        2.2.1.2 β-外毒素  19
    2.3 Bt对植物寄生线虫的作用机理  19-20
    2.4 Bt杀线虫基因及基因工程  20
  3 研究目的和意义  20-21
第二章 产芽胞杆状细菌的纯化和鉴定  21-28
  1 实验材料与方法  21-23
    1.1 实验材料  21-22
      1.1.1 菌株  21
      1.1.2 待鉴定菌株的预培养  21
      1.1.3 培养基及试剂  21-22
      1.1.4 实验仪器  22
    1.2 实验方法  22-23
      1.2.1 YC-10的纯化  22
      1.2.2 YC-10的分子鉴定  22-23
        1.2.2.1 YC-10的总DNA的提取  22
        1.2.2.2 YC-10的16S rRNA鉴定  22-23
      1.2.3 YC-10生长曲线的测定  23
      1.2.4 YC-10的生理化学鉴定  23
  2 结果与分析  23-26
    2.1 YC-10的形态学鉴定  23-24
      2.1.1 YC-10的菌体特征  23-24
    2.2 YC-10的16S rRNA的同源性比对  24
    2.3 YC-10生长过程的对比鉴定  24-25
    2.4 YC-10的生理化学鉴定  25-26
  3 小结与讨论  26-28
第三章 YC-10摇瓶发酵条件和培养基筛选  28-40
  1 实验材料与方法  28-31
    1.1 实验材料  28-29
      1.1.1 主要培养基和试剂  28
      1.1.2 实验菌株  28
      1.1.3 主要仪器设备  28-29
    1.2 实验方法  29-31
      1.2.1 摇瓶发酵条件筛选  29-30
        1.2.1.1 YC-10初始摇瓶发酵体积的筛选  29
        1.2.1.2 YC-10生长曲线和pH值曲线的测定  29
        1.2.1.3 正交试验设计筛选YC-10的发酵条件  29-30
      1.2.2 YC-10培养基成分的筛选  30
      1.2.3 实验数据的统计  30-31
  2 结果与分析  31-38
    2.1 YC-10培养条件的筛选  31-33
      2.1.1 YC-10初始摇瓶发酵体积的确定  31
      2.1.2 YC-10生长曲线的测定  31-32
      2.1.3 YC-10培养条件的正交试验设计筛选结果  32-33
    2.2 YC-10的培养基成分筛选  33-37
      2.2.1 显著影响YC-10产胞量的培养基组分的PB实验筛选  33-34
      2.2.2 最陡爬坡实验  34-35
      2.2.3 响应面实验筛选YC-10培养基成分的最优搭配  35-37
    2.3 对最优培养基组分的验证  37-38
  3 小结与讨论  38-40
第四章 ICPS杀线虫作用和蛋白特性研究  40-46
  1 实验材料与方法  40-43
    1.1 实验材料  40
      1.1.1 实验材料  40
      1.1.2 主要试剂  40
      1.1.3 主要仪器设备  40
    1.2 实验方法  40-43
      1.2.1 伴胞晶体蛋白的制备  40
      1.2.2 ICPs的浓度测定  40-42
        1.2.2.1 蛋白质标准曲线的制备  41
        1.2.2.2 ICPs样品的测量  41-42
      1.2.3 ICPs的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  42-43
        1.2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备  42
        1.2.3.2 ICPs的电泳及凝胶染色  42-43
      1.2.4 ICPs对南方根结线虫J2的室内生测  43
        1.2.4.1 南方根结线虫J2的获得  43
        1.2.4.2 ICPs对南方根结线虫的毒性试验  43
  2 结果与分析  43-45
    2.1 蛋白质检测结果  43-44
    2.2 南方根结线虫形态、行为的观察结果  44-45
  3 小结与讨论  45-46
第五章 ICPS合成基因的克隆与原核表达  46-54
  1 实验材料与方法  46-51
    1.1 实验材料  46
      1.1.1 质粒与菌种  46
      1.1.2 试剂  46
      1.1.3 仪器  46
      1.1.4 试剂及培养基的配制  46
    1.2 实验方法  46-51
      1.2.1 cry基因片段的获得  46-47
        1.2.1.1 YC-10总DNA的提取  46-47
        1.2.1.2 YC-10的cry4基因的PCR扩增  47
      1.2.2 cry基因片段的全长基因克隆  47-50
        1.2.2.1 TAIL-PCR引物设计  47-48
        1.2.2.2 TAIL-PCR第一次PCR  48
        1.2.2.3 TAIL-PCR第二次PCR  48-49
        1.2.2.4 TAIL-PCR第三次PCR  49-50
        1.2.2.5 TAIL-PCR产物的鉴定  50
      1.2.3 cry基因完整开放阅读框的获得  50
      1.2.4 cry基因的ORF与pQE30的重组及其表达  50-51
        1.2.4.1 ICPs的合成基因与pQE30质粒的重组  50-51
  2 结果与分析  51-52
    2.1 ICPs合成基因完整序列的扩增结果  51
    2.2 cry-pQE30重组质粒的检测  51-52
  3 小结与讨论  52-54
    3.1 cry基因全长序列的PCR扩增  52-53
    3.2 cry基因的原核表达  53-54
论文总结与创新点  54-56
  1 论文总结  54-55
    1.1 苏云金芽胞杆菌的鉴定研究  54
    1.2 发酵条件的筛选  54-55
    1.3 ICPs的毒性及合成基因克隆  55
  2 创新点  55-56
参考文献  56-63
附录A 论文所用重要缩写词及中文全称  63-65
附录B 常用缓冲液及培养基配方  65-67
附录C 常用生化试剂及仪器  67-69
致谢  69-70
发表论文附录  70

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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