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清香大曲糖化酶的提取及宏蛋白质组学分析

作　者: 张武斌
导　师: 段江燕；张秀虹
学　校: 山西师范大学
专　业: 植物学
关键词: 汾酒大曲双水相体系糖化酶宏蛋白质组双向电泳
分类号: TS262.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

糖化酶是酿酒大曲的主要功能成分之一，不同大曲糖化酶活力及酶学特征都不同。一般大曲的研究多关注糖化酶的活力，而对糖化酶的来源不能确定。为了确定清香大曲糖化酶的微生物来源，进一步了解清香白酒的功能微生物，本实验利用多种方法提取清香大曲糖化酶，并用液相色谱质谱联用技术分析清香大曲蛋白质组成，为清香白酒功能微生物的确认提供可靠信息。本文采用PEG/(NH4)2SO4的双水相体系对汾酒大曲的粗酶液进行萃取，实验探讨了PEG分子量和浓度、(NH4)2SO4浓度等主要因素对糖化酶萃取的影响、并通过正交实验确定最佳的双水相体系。结果表明，在PEG2000浓度16%，(NH4)2SO4浓度18%，pH为7.5，加入5%NaCl溶液的双水相体系中，糖化酶的分配系数Ka和回收率Yt分别达到1.913和83.25%。该体系是一种高效、便捷的体系，为汾酒大曲的深入研究提供有效的理论依据。采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀、硫酸铵等沉淀法制备汾酒大曲的宏蛋白质组样品，并用双向电泳来检测制备效果，结果表明：TCA-丙酮沉淀法制备的样品经电泳分离后，减轻了杂质干扰,2-DE图谱中竖条纹干扰较少，获得的蛋白点形状规则、清晰且无明显重叠现象，优于其它两种方法；经过两次水化液溶解的蛋白样品在等电聚焦时能保持4000伏较高电压；上样量为300ug左右的粗蛋白溶于二次水化液能得到点数更多、分辨率高的电泳图谱。最终建立了汾酒大曲宏蛋白质组的双向电泳体系。通过对清香白酒生产常用的三种大曲从蛋白质组学的角度进行质谱鉴定，共得到122个蛋白组分，其中56个蛋白组分种类包括烯醇酶、歧化酶、糖苷酶、糖化酶、各种激酶等，另外66个蛋白组分是辅酶及结构蛋白组分。糖化酶是大曲的主要生化指标，大曲蛋白质成分分析发现，所有检测到的糖化酶均为米根霉产生，由此确认米根霉为清香白酒的功能菌。据推测清香白酒的酯化机制除了胞外酯化酶外，还有酵母菌胞内完成的酰基转移酶形成，本实验检测到只有酿酒酵母合成的乙醇-O-酰基转移酶，确认其为清香白酒酯化功能菌。为清香白酒酿造功能微生物的确认提供科学的理论依据。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 引言  10-20
  1.1 汾酒大曲糖化酶的研究  10-14
    1.1.1 糖化酶的结构组成及分类  10-11
    1.1.2 糖化酶的特性  11-12
      1.1.2.1 糖化酶的热稳定性和 pH 稳定性  11
      1.1.2.2 糖化酶的底物特异性  11-12
    1.1.3 双水相萃取技术  12-14
      1.1.3.1 双水相体系萃取原理  12-13
      1.1.3.2 影响双水相体系中物质分配的因素  13-14
  1.2 汾酒大曲蛋白组学与宏蛋白质组学的研究  14-18
    1.2.1 蛋白质组学的研究  14-17
      1.2.1.1 蛋白质组学的研究领域  15
      1.2.1.2 蛋白质组学的分离技术  15-16
      1.2.1.3 蛋白组学的鉴定技术  16-17
      1.2.1.4 生物信息学  17
    1.2.2 宏蛋白质组学的研究  17-18
  1.3 本研究的目的意义和主要内容  18-20
2 材料与方法  20-29
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 原材料  20-21
    2.1.2 试剂  21
    2.1.3 主要设备  21
  2.2 实验方法  21-29
    2.2.1 大曲蛋白样品的提取  21-22
    2.2.2 糖化酶的萃取  22-24
      2.2.2.1 糖化酶活力的测定  22
      2.2.2.2 PEG/(NH_4)_2SO_4体系双节线图  22
      2.2.2.3 双水相体系的制备  22
      2.2.2.4 PEG 分子量及浓度对糖化酶分配行为的影响  22-23
      2.2.2.5 其它因素对糖化酶分配行为的影响  23
      2.2.2.6 Starch-PAGE 电泳分析大曲糖化酶活力  23-24
    2.2.3 大曲宏蛋白组的研究  24-25
      2.2.3.1 主要试剂的配制  24-25
      2.2.3.2 蛋白样品的沉淀  25
      2.2.3.3 蛋白溶解方法  25
    2.2.4 蛋白定量（Bradford 法）  25-26
      2.2.4.1 标准曲线绘制  25-26
      2.2.4.2 样品浓度测定  26
    2.2.5 双向电泳过程  26-28
      2.2.5.1 等电聚焦电泳 IEF  26-27
      2.2.5.2 SDS-PAGE 电泳  27-28
      2.2.5.3 CBB G-250 染色  28
      2.2.5.4 扫描及图形分析  28
    2.2.6 蛋白质胶内酶解和质谱鉴定  28-29
      2.2.6.1 主要试剂的配制  28-29
      2.2.6.2 蛋白质胶内酶解  29
      2.2.6.3 LC-MS/MS 检测及数据处理  29
3 结果与分析  29-48
  3.1 双水相萃取糖化酶效果  29-35
    3.1.1 淀粉标准曲线的绘制  29-30
    3.1.2 PEG/(NH_4)_2SO_4双水相体系相图  30-31
    3.1.3 PEG 分子量对糖化酶的影响  31
    3.1.4 不同浓度 PEG 对糖化酶萃取的影响  31-32
    3.1.5 (NH_4)_2SO_4、pH、NaCl 浓度对糖化酶分配行为的影响  32-33
    3.1.6 正交实验  33-34
    3.1.7 Starch-PAGE 电泳分析双水相萃取前后糖化酶的活力  34-35
  3.2 汾酒大曲宏蛋白组学的研究  35-48
    3.2.1 蛋白质定量标准曲线的绘制  35
    3.2.2 不同制备方法对双向电泳结果的影响  35-37
    3.2.3 上样量对双向电泳的影响  37
    3.2.4 蛋白的溶解  37-38
    3.2.5 不同长度 IPG 胶条的比较  38
    3.2.6 汾酒大曲宏蛋白组的质谱鉴定  38-45
    3.2.7 汾酒大曲中蛋白质功能分析  45-46
    3.2.8 汾酒大曲中功能菌分析  46-48
4 讨论  48-50
5 结论  50-52
致谢  52-54
参考文献  54-57

清香大曲糖化酶的提取及宏蛋白质组学分析

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