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吸附树脂在埃博霉素发酵中的应用研究

作　者: 李灿
导　师: 刘新利
学　校:
专　业: 生物化工
关键词: 纤维堆囊菌埃博霉素树脂 α-酮戊二酸脱氢酶复合体树脂再生
分类号: TQ463
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

埃博霉素（Epothilones），一类具有促微管聚合活性的大环内酯类抗肿瘤化合物，在医药研究中被重点关注。因其化学合成过程过于复杂，所以目前以生物法合成为主流的研究趋势。目前世界上埃博霉素的生产和制备过程均选用对埃博霉素具有良好的吸附效果的罗门哈斯公司XAD-16大孔吸附树脂，研究表明，此树脂在埃博霉素的发酵过程中起着极其重要的作用。但是，此树脂不仅价格昂贵而且其用量很大，这对埃博霉素的生产来说，是很重要的影响因素。用于埃博霉素分离的主要是大孔吸附树脂，至今很少有研究其他类型的树脂，如离子交换树脂、螯合型树脂等在埃博霉素吸附中的作用。本文首先从30种国产树脂中寻找得到了比XAD-16吸附效果更好的混合树脂，当两种混合树脂（XD-5：D202=7:3）混合使用时，纤维堆囊菌So2161产埃博霉素A和B的产量较单独的大孔吸附树脂XAD-16的产量分别提高了252%和262%。然后进一步研究了混合树脂对埃博霉素合成的影响，通过研究发现，大孔吸附树脂XD-5对埃博霉素有更好的吸附能力，而阴离子交换树脂D202则显著促进了纤维堆囊菌的生长。α-酮戊二酸脱氢酶复合体（OGDHC）是三羧酸循环（TCA）中的关键酶，在纤维堆囊菌的生长代谢调控中起重要作用，其活性受氯离子的影响较明显。本文从酶活水平以及酶的基因表达量水平入手，研究阴离子交换树脂D202显著促进堆囊菌生长的机制。结果发现，阴离子交换树脂D202的加入可以提高ogdc的表达量，促进OGDHC的活性，D202的加入通过调节纤维堆囊菌生长过程中重要的酶的活性进而调控纤维堆囊菌的生长。本文最后又对吸附效果好的大孔吸附树脂进行了再生工艺的研究，采用不同的有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、四氯化碳和乙酸乙酯）对树脂进行处理，并利用原子力显微镜和模拟生物反应器技术分析了再生树脂的性能，检测结果显示经甲醇处理后再生的大孔吸附树脂与新树脂的性能无显著性差异，并且可重复使用5次。

全文目录

摘要  9-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-13
第1章绪论  13-21
  1.1 吸附树脂  13-14
    1.1.1 吸附树脂的简介  13
    1.1.2 吸附树脂在抗生素生产中的应用概况  13
    1.1.3 吸附树脂在埃博霉素发酵生产中的作用  13-14
  1.2 埃博霉素产生菌的简介  14-15
    1.2.1 粘细菌  14
    1.2.2 纤维堆囊菌  14
    1.2.3 纤维堆囊菌的次级代谢产物  14-15
    1.2.4 纤维堆囊菌现研究存在的问题  15
  1.3 埃博霉素的简介  15-17
    1.3.1 埃博霉素的结构及生物活性  15-16
    1.3.2 埃博霉素的合成前体和途径分析  16-17
    1.3.3 埃博霉素的研究现状和应用前景  17
  1.4 α-酮戊二酸脱氢酶复合体（OGDHC）  17-19
    1.4.1 α-酮戊二酸脱氢酶复合体简介  17-18
    1.4.2 α-酮戊二酸脱氢酶复合体活性测定方法  18
    1.4.3 α-酮戊二酸脱氢酶复合体的研究进展  18-19
  1.5 课题的研究内容及总体思路  19-21
    1.5.1 研究内容  19-20
    1.5.2 总体思路  20-21
第2章不同树脂对埃博霉素的吸附研究  21-33
  2.1 引言  21
  2.2 实验材料  21-24
    2.2.1 菌株  21
    2.2.2 仪器  21-22
    2.2.3 试剂  22
    2.2.4 培养基和配制试剂  22-23
    2.2.5 树脂种类及处理方法  23-24
  2.3 实验方法  24-27
    2.3.1 纤维堆囊菌 So 2161 的培养  24
    2.3.2 埃博霉素标准曲线绘制  24-25
    2.3.3 单一树脂吸附差异实验  25
    2.3.4 复合树脂吸附差异实验  25
    2.3.5 复合树脂配比条件优化  25-26
    2.3.6 树脂添加时间的优化  26
    2.3.7 树脂添加量的优化  26-27
  2.4 实验结果与讨论  27-31
    2.4.1 埃博霉素的标准曲线  27
    2.4.2 单一树脂吸附差异分析  27-28
    2.4.3 复合树脂吸附差异分析  28-29
    2.4.4 复合树脂配比条件优化结果  29-30
    2.4.5 树脂的最佳添加时间  30
    2.4.6 最适树脂添加量的确定  30-31
  2.5 本章小结  31-33
第3章混合树脂对埃博霉素合成的影响  33-45
  3.1 引言  33
  3.2 实验材料  33-36
    3.2.1 菌株  33
    3.2.2 仪器  33-34
    3.2.3 试剂  34-35
    3.2.4 培养基和配制试剂  35-36
  3.3 实验方法  36-38
    3.3.1 不同类型树脂吸附成分多样性分析  36
    3.3.2 D202 树脂促进堆囊菌生长的初步分析  36-38
    3.3.3 阴离子的添加验证实验  38
  3.4 实验结果与讨论  38-43
    3.4.1 不同树脂吸附成分多样性分析  38-40
    3.4.2 D202 树脂促进堆囊菌生长的结果分析  40-43
    3.4.3 阴离子的添加验证实验  43
  3.5 本章小结  43-45
第4章 D202 促进纤维堆囊菌生长的原因分析  45-59
  4.1 引言  45
  4.2 实验材料  45-47
    4.2.1 菌株  45
    4.2.2 仪器  45-46
    4.2.3 试剂  46-47
    4.2.4 培养基及试剂盒  47
    4.2.5 酶活检测方法  47
  4.3 实验方法  47-52
    4.3.1 纤维堆囊菌的发酵培养  47-48
    4.3.2 粗酶提取及酶活测定  48-49
    4.3.3 纤维堆囊菌中总 DNA 的提取  49
    4.3.4 引物设计及确定  49-50
    4.3.5 RNA 提取  50-51
    4.3.6 cDNA 的合成  51-52
    4.3.7 QPCR 分析  52
    4.3.8 埃博霉素产量的测定  52
  4.4 实验结果  52-56
    4.4.1 蛋白质标准曲线的制作  52-53
    4.4.2 OGDHC 的活性与埃博霉素的产量关系  53-54
    4.4.3 引物的确定  54-55
    4.4.4 RNA 浓度及纯度的确定  55-56
    4.4.5 基因转录水平分析  56
  4.5 本章小结  56-59
第5章树脂再生工艺的研究  59-69
  5.1 引言  59
  5.2 实验材料  59-61
    5.2.1 菌株  59
    5.2.2 仪器  59
    5.2.3 试剂  59-60
    5.2.4 培养基及配制试剂  60-61
  5.3 实验方法  61-62
    5.3.1 树脂的处理  61
    5.3.2 再生树脂的孔径测定  61
    5.3.3 再生树脂的发酵验证  61
    5.3.4 再生树脂的抗压性能测定  61-62
    5.3.5 再生树脂的重复利用次数验证  62
    5.3.6 中试实验  62
    5.3.7 埃博霉素产量的测定  62
  5.4 实验结果  62-67
    5.4.1 不同有机溶剂处理的树脂吸附能力差异的分析  62-63
    5.4.2 再生树脂的孔径分析  63-64
    5.4.3 再生树脂的抗压性能分析  64-65
    5.4.4 再生树脂的重复利用次数分析  65-67
    5.4.5 中试实验结果  67
  5.5 本章小结  67-69
全文总结与展望  69-71
参考文献  71-77
致谢  77-79
在学期间主要科研成果  79

吸附树脂在埃博霉素发酵中的应用研究

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