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水稻RACK1基因（OsRACK1）在种子萌发进程中的功能研究

作　者: 陈丽
导　师: 梁建生
学　校: 扬州大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻 RACK1 萌发 ABA
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

RACK1蛋白编码基因最早在动物中发现,后来在许多真核生物中都发现了动物RACK1基因的同源基因。哺乳动物RACK1是一种支架蛋白,并可以与许多信号分子相互作用调节不同的信号转导途径。植物细胞中RACK1蛋白的功能相对研究较少,目前还不能确定是否与动物RACK1一样发挥支架作用,但由于植物RACK1蛋白氨基酸序列与动物RACK1蛋白高度相似,并且含有动物RACK1蛋白的结构功能域,因此可以推测植物RACK1蛋白可能具有动物RACK1蛋白的部分功能。植物RACK1基因最初是作为烟草BY-2悬浮细胞的一个生长素诱导基因被发现的,后来的研究也证明RACK1蛋白参与植物多种与激素有关的信号转导过程。水稻RACK1蛋白最早在1995年被报道。后来的研究发现水稻悬浮细胞中RACK1的表达可以被生长素、脱落酸以及茉莉酸甲酯等激素诱导；而水稻种子吸胀时ABA能引起RACK1蛋白的大量积累。由于赤霉素、脱落酸等激素对种子萌发的影响依赖于G蛋白信号途径,因此推断水稻中的RACK1蛋白可能通过调节G蛋白来控制激素信号响应;反之,G蛋白也可能通过调节RACK1来影响激素信号通路。本研究以RACK1基因干扰、过表达及野生型植株为材料,通过对不同基因型水稻种子萌发阶段施加不同浓度的外源ABA、H2O2等,观察不同条件对水稻种子萌发的影响,并通过相对定量PCR测定萌发进程中RACK1基因的表达情况,种子萌发过程中一些酶的表达水平,及其在萌发不同时期的ABA及H2O2的含量,以期了解种子萌发中RACK1蛋白与ABA或其他激素信号转导的关系。为RACK1蛋白在水稻种子萌发中的功能及与G蛋白信号转导的关系研究提供依据。研究获得的主要结果如下：1.种子萌发进程试验结果显示,与WT,OX相比, RACK1A RNAi干扰植株的种子萌发延迟。外源ABA处理下,RNAi种子萌发率迅速下降,与WT,OX相比表现出对ABA超敏感。证明RACK1A参与调控种子萌发过程。2.用不同浓度的ABA溶液处理水稻种子,发现与对照相比,处理后RACK1A蛋白表达水平下降。外源ABA处理种子后,RACK1表达下降,并导致H202含量下降,萌发延迟,加入外源H202可以恢复ABA引起的萌发延迟。说明ABA通过抑制RACK1,从而抑制萌发促进剂H202抑制种子萌发。但是,外源H2O2不能消除不同基因型之间的萌发差异。3.通过qPCR以及淀粉酶的酶活测定发现,RNAi株系水稻中两种淀粉酶的表达水平与酶活性皆低于WT, OX。说明ABA可能通过抑制RACK1蛋白的表达阻碍种子萌发。4.用基于序列分析的蛋白质跨膜预测软件对RACK1A进行序列分析,发现其没有跨膜结构域,预测其为一种细胞质蛋白。通过原生质体瞬时表达技术,将YFP-RACK1A转入水稻原生质体中,发现YFP-RACK1A荧光分布于整个细胞质,表明RACK1A定位在细胞质中。5.对萌发24h、48h种子的ABA、H2O2含量进行了测定。结果显示,RNAi株系种子萌发24h、48h时ABA含量显著高于WT, WT与OX种子中ABA含量基本无差异。RNAi种子萌发24h、48h时,RNAi种子内源H202显著低于WT种子；OX种子中H2O2含量略大于WT。说明RACK1A可能通过某种方式抑制了ABA的合成,并促进了过氧化氢的生成。综上所述,本研究证明水稻可影响种子中ABA的合成,通过维持或增加H2O2的量促进种子萌发进程,此外,RACK1还参与控制淀粉酶表达及活性影响种子萌发。而外源ABA可降低种子中RACK1的表达水平抑制种子萌发,说明ABA与RACK1之间存在较复杂的信号调控网络。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
英文缩略词  8-10
第一章文献综述  10-26
  1.1 引言  10
  1.2 种子萌发研究  10-17
    1.2.1 种子萌发的转录调控  10-11
    1.2.2 氧化还原系统与种子萌发  11-16
      1.2.2.1 活性氧的产生与特性  11-12
      1.2.2.2 植物的抗氧化系统  12-14
      1.2.2.3 ROS与种子萌发  14-16
    1.2.3 ABA和GA与种子萌发  16-17
  1.3 植物中的RACK1蛋白研究进展  17-26
    1.3.1 植物RACK1蛋白的发现  17-18
    1.3.2 RACK1蛋白的结构  18-19
    1.3.3 植物中RACK1蛋白的功能  19-24
      1.3.3.1 植物RACK1参与蛋白翻译过程  19-20
      1.3.3.2 RACK1蛋白与植物激素信号转导  20-22
      1.3.3.3 RACK1蛋白参与G蛋白信号通路  22-24
    1.3.4 RACK1与种子萌发  24-26
第二章材料与方法  26-33
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 试剂与材料  26-27
  2.2 实验方法  27-33
    2.2.1 种子萌发实验  27
    2.2.2 RACK1蛋白表达分析  27-29
      2.2.2.1 水稻种子蛋白提取  27
      2.2.2.2 Western Blot分析  27-29
    2.2.3 RT-PCR  29-30
      2.2.3.1 水稻RNA提取  29
      2.2.3.2 RNA纯度及浓度检测  29
      2.2.3.3 第一链cDNA合成  29-30
    2.2.4 水稻组织中ABA含量的测定  30-31
      2.2.4.1 水稻组织ABA的提取  30
      2.2.4.2 ABA的放射免疫测定  30-31
    2.2.5 水稻原生质体瞬时表达分析  31
    2.2.6 α-淀粉酶测定  31-33
第三章结果与分析  33-42
  3.1 转基因水稻株系的鉴定与分析  33-34
  3.2 不同处理对三种基因型水稻种子萌发的影响  34-36
  3.3 三种基因型水稻萌发期间α-淀粉酶基因表达及酶活性检测  36-37
  3.4 种子萌发进程中RACK1A蛋白的表达情况  37-38
  3.5 三种基因型水稻萌发期间ABA及H_2O_2含量变化  38-39
  3.6 ABA对水稻种子RACK1A基因表达和RACK1A蛋白表达的影响  39-40
  3.7 水稻RACK1A蛋白细胞定位  40-42
第四章小结与讨论  42-44
  4.1 小结与讨论  42-44
参考文献  44-54
附录  54-56
致谢  56-57

水稻RACK1基因（OsRACK1）在种子萌发进程中的功能研究

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