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AtRFC5对拟南芥植株生长发育的调控作用研究

作　者: 陈良城
导　师: 夏石头
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物学
关键词: AtRFC5 基因突变生长发育 DNA复制损伤修复拟南芥
分类号: Q945
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

RFC(replication factor C,复制因子C)是一种首先从人类宫颈癌Hela细胞提取物中纯化的DNA体外复制的必需因子,并普遍存在于真核生物中。随着研究的不断深入,RFC复合蛋白复合物作为一个整体,其在DNA复制和修复及细胞分裂增殖与抗逆生长中的重要功能也逐渐被人们所认识。但植物中有关RFC各亚基的生物学功能及其对植物生长发育的调控等,仍是当前学科发展中亟待解析的问题之一。本研究通过RNAi干涉试验筛选获得rfc5突变体纯合子,然后以WT、rfc5、 rfc3-1、rfc5rfc3和rfc3-1/RFC3植株为材料,研究了基因突变对植株抗逆性及其抵抗不同浓度DNA复制毒性物质甲基磺酸甲酯(Methyl Methanesulfonate,MMS)和顺铂(cisplatin)的影响,解析了RFC5基因对拟南芥生长发育的调控作用。获得如下主要试验结果:1.通过筛选获得了表型稳定的rfc5突变体,与野生型植株相比,rfc5纯合子植株具有株型较小,早花,叶片较小、叶缘锯齿不明显,分枝甚少,根系较短且侧根较少等表型,说明AtRFC5基因突变显著影响了植株的生长发育。2.将rfc5突变体与生长发育相关突变体rfc3、rfc1和pcna2杂交,得到了杂交后代双突变体植株。通过特异引物PCR鉴定了rfc5rfc3双突变体纯合子植株,而rfc5rfc1、c5pcna2双突变体植株有待于进一步的检验。3.随着MMS和cisplatin浓度上升,WT、rfc3-1和rfc3-1/RFC3植株生长受抑制程度而增强,rfc3-1植株主根长和真叶数极显著或显著少于WT和rfc3-1/RFC3植株的,遗传互补植株rfc3-1/RFC3则恢复了rfc3-1的野生型表型。荧光定量PCR结果则进一步印证了rfc3-1植株的抗复制损伤修复能力被削弱,表明AtRFC3对植株抗DNA复制损伤修复和抗性生长具有重要调控作用。4.AtRFC5基因突变削弱了rfc5植株抗复制损伤修复能力,荧光定量PCR结果与rfc3-1和rfc5rfc3植株离体叶片的电导率,进一步说明了RFC5基因突变削弱了植株的抗性,AtRFC5对植株抗DNA复制损伤修复和抗性生长具有重要调控作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-10
第一章绪论  10-17
  1 前言  10-15
    1.1 国内外研究现状  10-11
    1.2 RFC分子特性和功能  11-12
    1.3 RFC各亚基的分子特性和功能  12-15
      1.3.1 酵母和人类RFC各亚基的分子特性和功能  12-14
      1.3.2 植物RFC各亚基的分子特性和功能  14-15
  2 复制因子C的分子结构模型  15-16
  3 本研究的目的及意义  16-17
第二章 AtRFC5基因突变体的筛选与鉴定  17-24
  1 材料和试剂  17
    1.1 试验材料  17
    1.2 主要药品和试剂  17
    1.3 主要实验仪器设备  17
  2 试验方法  17-21
    2.1 试验材料的种植方法  17-18
    2.2 拟南芥RFC5基因的RNAi干涉试验  18-19
    2.3 拟南芥rfc5突变体的表型筛选  19
    2.4 拟南芥rfc5突变纯合体的鉴定  19-21
      2.4.1 植株总RNA的提取  19-20
      2.4.2 逆转录合成cDNA第一链  20-21
      2.4.3 RFC5基因表达量检测  21
  3 结果与分析  21-23
    3.1 多代筛选获得表型稳定的rfc5突变体  21-22
    3.2 拟南芥rfc5突变纯合体的鉴定  22-23
  4 小结与讨论  23-24
第三章 AtRFC5基因突变对植株抗逆性的影响  24-29
  1 材料和试剂  24
    1.1 试验材料  24
    1.2 主要药品和试剂  24
  2 试验方法  24-25
    2.1 试验材料的种植方法  24
    2.2 MMS和Cisplatin试验处理  24
    2.3 电导率仪法测定离体植株叶片的电导率  24-25
  3 结果与分析  25-28
    3.1 RFC5基因突变对植株抗MMS损伤的影响  25-26
    3.2 RFC5基因突变对植株抗cisplatin损伤的影响  26-28
    3.3 RFC5基因突变对植株叶片电导率的影响  28
  4 小结与讨论  28-29
第四章 AtRFC3基因突变对植株复制损伤修复能力的影响  29-38
  1 试验材料与试剂  29
  2 试验方法  29-31
    2.1 材料种植  29
    2.2 MMS和Cisplatin试验处理  29
    2.3 总RNA的提取及逆转录  29-30
    2.4 荧光定量PCR(real time PCR)检测目的基因表达量  30
    2.5 电导率仪法测定离体植株叶片的电导率  30-31
  3 结果与分析  31-36
    3.1 RFC3基因突变对植株抗MMS损伤的影响  31-33
    3.2 RFC3基因突变对植株抗cisplatin损伤的影响  33-35
    3.3 RFC3基因突变对植株复制损伤修复相关基因表达的影响  35-36
    3.4 RFC3基因突变对植株叶片电导率的影响  36
  4 小结与讨论  36-38
第五章 rfc5基因双突变体的筛选与鉴定  38-45
  1 材料和试剂  38
    1.1 试验材料  38
    1.2 主要药品和试剂  38
  2 试验方法  38-41
    2.1 试验材料的种植方法  38
    2.2 rfc5突变体与rfc3、rfc1、pcna2突变体相互杂交  38-39
    2.3 rfc5rfc3双突变体植株的筛选与鉴定  39-40
      2.3.1 rfc5rfc3双突变体植株DNA的提取  39
      2.3.2 rfc5rfc3双突变体植株rfc3突变基因的检测  39-40
      2.3.3 ryc5rfc3双突变体植株rfc5突变基因的鉴定  40
    2.4 rfc5rfc1双突变体植株的筛选与鉴定  40-41
      2.4.1 rfc5rfc1双突变体植株rfc1突变基因的鉴定  40-41
      2.4.2 rfc5rfc1双突变体植株rfc5突变基因的鉴定  41
    2.5 rfc5pcna2双突变体植株的筛选与鉴定  41
  3 结果与分析  41-44
    3.1 rfc5突变体与rfc3、rfc1、pcna2突变体杂交结果  41-42
    3.2 杂交后代植株rfc3、rfc1突变基因的鉴定  42-43
    3.3 杂交后代植株RFC5基因表达量的检测  43-44
  4 小结与讨论  44-45
第六章 RFC5与RFC3基因双突变对植株根和叶生长发育的影响  45-52
  1 材料和试剂  45
    1.1 试验材料  45
    1.2 主要药品和试剂  45
  2 试验方法  45-46
    2.1 试验材料的种植方法  45
    2.2 MMS和Cisplatin试验处理  45
    2.3 处理植株总RNA的提取及逆转录  45
    2.4 荧光定量PCR(real time PCR)检测目的基因表达量  45
    2.5 电导率仪法测定离体植株叶片的电导率  45-46
  3 结果与分析  46-51
    3.1 RFC5与RFC3基因双突变对植株抗MMS损伤的影响  46-48
    3.2 RFC5与RFC3基因双突变对植株抗cisplatin损伤的影响  48-50
    3.3 RFC5与RFC3基因双突变对植株复制损伤修复相关基因表达的影响  50-51
    3.4 RFC5与RFC3基因双突变对植株叶片电导率的影响  51
  4 小结与讨论  51-52
全文总结与展望  52-55
  1 全文总结  52-53
  2 本研究的创新点  53
  3 展望  53-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
作者简介  61

AtRFC5对拟南芥植株生长发育的调控作用研究

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