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猪圆环病毒2型单抗阻断ELISA方法的建立与核酸疫苗重组体的构建及免疫特性研究

作　者: 杨香林
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PCV2 B细胞表位阻断ELISA 核酸疫苗沙门氏菌
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道复合体病和繁殖障碍等多种临床疾病,这些疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVD)。其中PMWS可导致机体产生严重的免疫抑制,严重影响养猪业发展。PCV2ORF2编码的Cap蛋白,是病毒的主要结构蛋白,包含多个B细胞表位和中和表位,具有良好的抗原性,能诱导产生保护性免疫反应。本研究应用Cap蛋白单克隆抗体建立了PCV2阻断ELISA抗体检测方法；构建了表达修饰的Cap蛋白的真核质粒及重组减毒沙门氏菌,并对其进行免疫特性分析。为PCV2诊断方法和PCV2基因工程疫苗研究奠定了基础。本研究具体内容如下：1.猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体5H7B细胞表位的鉴定本研究利用PCR方法将Cap蛋白基因的4个片段分别克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化大肠杆菌BL21,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达(CapF(51-180aa)、CapG(169-200aa)、CapH(51-162aa)、CapI(156-234aa))。同时利用另外5个Cap蛋白片段CapA(51-150aa)、CapB(51-200aa)、CapC(51-234aa)、 CapD (101-200aa)、CapE (101-234aa),通过Western blot方法,对PCV2Cap蛋白单克隆抗体5H7所识别的B细胞抗原表位进行了精确定位。结果显示,单抗5H7能够识别的位点是Y(156)HSRYFT(162),位于Cap蛋白的156-162aa。应用DNAStar软件将表位Y(156)HSRYFT(162)与22株不同来源的PCV2a和PCV2b流行毒株进行氨基酸序列比对,证明该表位高度保守,为进一步研究Cap相关功能及PCVD诊断方法奠定了重要基础。2.猪圆环病毒2型阻断ELISA检测方法的建立和应用本研究应用纯化的PCV2重组Cap蛋白和辣根过氧化酶标记的Cap蛋白单抗建立了检测PCV2抗体的阻断ELISA方法。经条件优化确定,抗原最佳包被条件为浓度2μg/mL,37℃2h;最佳封闭条件为1%BSA,37℃3h;待检血清最佳作用条件为稀释度1：l,37℃2h；酶标单抗最佳作用条件为稀释度1:5000,37℃0.5h; TMB最佳显色时间为37℃15min。通过对33份PCV2阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥40.30%时为阳性,PI≤28.46%时为阴性,28.46%<PI<40.30%时为可疑。应用本方法对100份血清样品进行检测,以间接ELISA结果为标准,阻断ELISA的敏感性和特异性分别为84%和94%,符合率为89%。使用该方法检测猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)、猪嗜血支原体(M. suis)等参考阳性血清,结果均为阴性；批内和批间重复性试验结果变异系数均小于10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用该阻断ELISA方法检测不同地区送检的311份临床血清,总阳性检测率为85.53%,证明该方法具有较好的临床应用前景。3. PCV2ORF2基因修饰及其真核表达质粒的构建与鉴定为了提高PCV2ORF2基因免疫特性,本研究对PCV2SH毒株ORF2基因进行了修饰,包括(1)根据哺乳动物偏嗜性,对天然的Cap基因密码子进行优化,改成哺乳动物偏嗜的基因,并在起始密码子上游添加KOZAK序列；(2)在序列(1)的基础上,将起始密码子后第一位碱基C改变成G,形成KOZAK最优序列；(3)通过口蹄疫病毒的自身裂解蛋白酶2A基因将两个优化的Cap序列(1)连接。获得3个修饰的Cap基因SynCap、SynCap (m)、SynCap-2A-SynCap,并用PCR扩增Cap/SynCap,分别克隆至pVAX1真核表达质粒,获得4个重组真核质粒pVAX-Cap、pVAX-SynCap、 pVAX-SynCap (m)和pVAX-SynCap-2A-SynCap,经酶切鉴定及基因测序证明具有正确ORF2,然后将这些重组真核质粒用脂质体法转染BHK-21细胞,采用Western blot法对目的蛋白进行相对定量,结果显示优化后的基因蛋白表达量明显提高,为PCV2核酸疫苗研究奠定了重要基础。4.表达修饰的Cap蛋白的真核质粒及其重组减毒沙门氏菌的免疫特性研究本研究在获得pVAX-SynCap、pVAX-Cap、pVAX-SynCap-2A-SynCap和pVAX-SynCap (m)真核质粒的基础上,进行了相关的免疫特性研究。小鼠免疫试验结果显示,pVAX-SynCap、pVAX-SynCap (m)组可以有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答(P>0.05),其中以pVAX-SynCap (m)免疫刺激效果最好。这表明优化哺乳动物偏嗜密码子及应用KOZAK最优序列,可以明显提高Cap蛋白表达量及其免疫原性。选择pVAX-SynCap (m),将其转染减毒沙门氏菌SL3263株,构建成重组沙门氏菌SL-pVAX-SynCap (m),分别与pVAX-SynCap (m)质粒、pVAXl空质粒、SL和PBST进行猪体免疫保护试验,并设立空白对照。结果为：首免后2周,基本上检测不到PCV2抗体,首免后5周pVAX-SynCap (m)抗体水平为1：150,SL-pVAX-SynCap (m)抗体水平为1：280,这两组均未检测到中和抗体,其它组均未产生相应的体液免疫应答。攻毒后SL-pVAX-SynCap (m)及pVAX-SynCap (m)仅出现短时间的发热,临床症状较轻,相对日增重与攻毒对照组差异显著(P<0.05),SL-pVAX-SynCap (m)免疫组在病毒血症、淋巴结病毒载量和病理学变化方面明显轻于攻毒对照组,pVAX-SynCap (m)免疫组居中。该研究结果表明,SL-pVAX-SynCap(m)免疫组具有较好免疫保护作用,pVAX-SynCap (m)免疫组的保护作用较低,减毒沙门氏菌作为载体后可提高质粒DNA对机体的免疫保护作用。综上所述,本研究利用一株针对保守表位序列的单抗,构建了PCV2阻断ELISA方法,并证明该方法具有良好的特异性。修饰后的ORF2基因在免疫原性方面比修饰前得到明显提高,重组沙门氏菌SL-pVAX-SynCap (m)免疫猪体体液免疫应答更加明显,对同源毒株攻毒具有一定的免疫保护效果。以上研究为PCVD的诊断及核酸疫苗的开发奠定了重要基础。

全文目录

摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
文献综述  15-37
  第一章猪圆环病毒2型及其疫苗的研究进展  15-37
    1 猪圆环病毒的分子生物学特性  15-22
      1.1 病毒的分类地位  15-16
      1.2 病毒的形态学及理化特性  16-17
      1.3 基因组结构及编码蛋白  17-21
      1.4 相关的表位研究  21-22
    2 猪圆环病毒病的诊断方法研究  22-25
      2.1 病原学方法  22-24
      2.2 血清学方法  24-25
    3 猪圆环病毒二型疫苗研究进展  25-31
      3.1 灭活疫苗  26
      3.2 弱毒疫苗  26
      3.3 活载体疫苗  26-27
      3.4 亚单位疫苗  27
      3.5 DNA疫苗  27-31
    参考文献  31-37
研究内容  37-103
  第二章猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体5H7 B细胞表位的鉴定  37-51
    摘要  37-38
    1 材料与方法  38-43
      1.1 毒株、质粒及其他材料  38
      1.2 Cap蛋白基因分段克隆引物设计及合成  38-39
      1.3 目的基因的扩增  39
      1.4 PCR产物的克隆  39-41
      1.5 重组质粒的鉴定  41
      1.6 目的蛋白的表达  41
      1.7 目的蛋白的SDS-PAGE分析  41
      1.8 目的蛋白的Western blot鉴定  41-42
      1.9 Western blot鉴定Cap蛋白B细胞表位  42
      1.10 Cap蛋白抗原表位的变异分析  42-43
    2 结果  43-47
      2.1 CapF/G/H/I基因片段的扩增  43-44
      2.2 重组质粒pET-32a-CapE/F/G/H的构建与鉴定  44-45
      2.3 重组蛋白的表达及鉴定  45-46
      2.4 Western blotting方法鉴定Cap蛋白B细胞表位  46
      2.5 Cap B细胞表位保守性分析  46-47
    3 讨论  47-49
    参考文献  49-50
    ABSTRACT  50-51
  第三章猪圆环病毒2型单抗阻断ELISA抗体检测方法的建立和应用  51-71
    摘要  51-52
    1 材料与方法  52-56
      1.1 试剂、菌株、细胞及血清  52
      1.2 抗原蛋白的表达与纯化  52-53
      1.3 单克隆抗体的纯化及辣根过氧化酶(HRP)标记  53-54
      1.4 阻断ELISA术式  54
      1.5 阻断ELISA最佳反应条件的选择  54-55
      1.6 阻断ELISA临界值的确定  55-56
      1.7 阻断ELISA的敏感性试验  56
      1.8 阻断ELISA特异性试验  56
      1.9 阻断ELISA的重复性试验  56
      1.10 符合率的测定  56
      1.11 临床血清样品的检测  56
    2 结果  56-68
      2.1 抗原蛋白的表达优化及纯化结果  56-60
      2.2 单克隆抗体的纯化和HRP标记  60-61
      2.3 阻断ELISA最佳反应条件的选择  61-65
      2.4 阻断ELISA临界值的确定  65-66
      2.5 阻断ELISA的敏感性  66
      2.6 阻断ELISA的特异性  66
      2.7 阻断ELISA的重复性  66-67
      2.8 阻断ELISA的符合率  67
      2.9 临床血清样品的检测  67-68
    3 讨论  68-69
    参考文献  69-70
    ABSTRACT  70-71
  第四章 PCV2 ORF2基因修饰及其真核表达质粒的构建与鉴定  71-83
    摘要  71-72
    1 材料  72
      1.1 质粒、菌株与细胞  72
      1.2 试剂  72
    2 方法  72-77
      2.1 PCV2 ORF2基因修饰设计思路  72-73
      2.2 PCV2 ORF2基因的扩增  73
      2.3 修饰的ORF2基因的获得  73-74
      2.4 重组真核质粒的构建  74-76
      2.5 重组质粒的真核表达鉴定  76-77
    3 结果  77-79
      3.1 Cap、SynCap、SynCap(m)及SynCap-2A基因的获得  77-78
      3.2 重组真核质粒的构建与鉴定  78
      3.3 Western blot鉴定目的蛋白表达  78-79
    4 讨论  79-81
    参考文献  81-82
    ABSTRACT  82-83
  第五章表达修饰的Cap蛋白的真核质粒及其重组减毒沙门氏菌的免疫特性研究  83-103
    摘要  83-84
    1 材料  84
      1.1 质粒、菌株和病毒  84
      1.2 试剂  84
      1.3 实验动物  84
    2 方法  84-91
      2.1 质粒的大量制备  84-85
      2.2 小鼠免疫试验  85-87
      2.3 重组减毒沙门氏菌的构建及鉴定  87-88
      2.4 仔猪攻毒保护试验  88-91
      2.5 数据统计分析  91
    3 结果  91-99
      3.1 小鼠免疫试验结果  91-93
      3.2 重组减毒沙门氏菌的鉴定  93-94
      3.3 猪体免疫攻毒试验结果  94-99
    4 讨论  99-101
    参考文献  101-102
    ABSTRACT  102-103
全文总结  103-105
附录  105-109
致谢  109

猪圆环病毒2型单抗阻断ELISA方法的建立与核酸疫苗重组体的构建及免疫特性研究

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