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黄病毒解旋酶来源的富含精氨酸肽对日本脑炎病毒抑制作用的研究

作　者: 胡小春
导　师: 茅翔
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本脑炎病毒 黄病毒科 抗病毒肽 解旋酶
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


日本脑炎病毒(JEV)属于黄病毒科,是引起人类和动物急性病毒性脑炎的病原之一,以蚊为传播媒介在人和动物中传播。人感染JEV后引起不可逆的神经系统损害,死亡率在20-50%；猪感染JEV后引起妊娠母猪流产,产死胎、木乃伊胎、弱仔,公猪睾丸炎,严重危害人类健康以及养殖业发展。JEV基因组编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白,其中非结构蛋白NS3是一个多功能的大分子蛋白,性质保守,具有蛋白酶和NTP酶／解旋酶活性,NS3在病毒多蛋白加工和基因组复制及病毒与宿主细胞的相互作用过程中扮演十分重要的作用,其完整的酶学活性对病毒的增殖是必不可少的,是潜在的抗病毒研究靶点。抗病毒肽是一类对病毒有杀伤作用或抑制作用的小分子多肽,在病毒感染早期就能对病毒产生抑制作用,越来越多的研究证明了多肽对许多病毒有抗病毒作用,包括艾滋病病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、禽流感病毒(AIV)等,因此抗病毒肽具有广阔的应用前景。有研究报道来源于HCV、JEV、WNV解旋酶保守的富含精氨酸肽能够抑制解旋酶的活性。本试验合成了来源于CSFV、DENV、JEV、HCV、WNV解旋酶富含精氨酸的5个肽,通过实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术、噬斑试验、组织病理学与免疫组化研究、动物试验等方法研究这些肽对JEV的抑制作用。我们的结果证实了这些富含精氨酸肽能够有效的穿过细胞膜迅速的定位到细胞质,而且这些肽在细胞中能至少稳定48小时,细胞毒性试验的结果证明这些肽在细胞中没有明显的细胞毒性。这些肽在体内和体外对JEV都有不同程度的抑制作用,其有效浓度EC50在微摩尔范围之内。在100μM浓度时Pjev、Pcsfv和Phcv强烈抑制了病毒RNA水平,减少了JEV囊膜蛋白的表达,在EC5015μM时抑制了JEV在BHK-21细胞内的复制。动物试验显示肽能延迟JEV攻毒小鼠的死亡时间,减弱临床症状。与其他肽相比,Pjev抑制JEV的效果更好,预处理Pjev降低了小鼠的死亡率,对小鼠有75%的保护率,其他肽尽管不能保护所有的小鼠免受致死剂量的JEV感染,但是延迟了小鼠的死亡时间,减弱了临床症状。总的说来,本试验鉴定出能够抑制JEV感染的没有细胞毒性的肽,这些富含精氨酸肽有效抑制了JEV在BHK-21细胞内增殖。用肽预处理小鼠能够提高致死剂量JEV攻毒的存活率,Pjev具有较高的治疗指数和体内疗效。Pjev、Phcv、Pcsfv是极具潜力的抗JEV感染的抗病毒制剂,这些肽经过修饰后,也许能成为肽类抗病毒药物,可以作为研发新的抗JEV的基础。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
文献综述  12-32
  第一章 抗病毒肽的研究进展  12-20
    1 抗病毒肽的结构及性质  12-13
    2 抗病毒肽的作用机制  13-14
      2.1 直接作用于病毒粒子  13
      2.2 干扰病毒入胞  13-14
      2.3 抑制病毒颗粒的形成  14
      2.4 抑制病毒颗粒的释放  14
    3 抗病毒肽的应用前景  14-16
    参考文献  16-20
  第二章 日本脑炎的研究进展  20-32
    1 病原  20-23
      1.1 形态学特征及理化特性  20
      1.2 分子生物学特征  20-23
    2 流行病学  23-24
    3 临床症状及病理特征  24-25
    4 发病机理  25
    5 诊断  25
    6 防制  25-27
      6.1 加强疫苗接种工作  26
      6.2 加强对传播媒介的监控  26-27
    参考文献  27-32
实验部分  32-58
  第三章 黄病毒解旋酶来源的富含精氨酸肽对日本脑炎病毒抑制作用的研究  32-58
    1 试验材料  33-35
      1.1 细胞、病毒、试验动物  33
      1.2 抗体  33
      1.3 主要试剂及试剂盒  33-34
      1.4 仪器设备及其他材料  34
      1.5 溶液  34-35
    2 试验方法  35-41
      2.1 细胞复苏与培养  35
      2.2 病毒扩增及滴度测定  35-36
      2.3 肽的设计和合成  36
      2.4 荧光显微镜检术检测肽的入胞及细胞内的分布  36
      2.5 肽体外抗JEV活性研究  36-39
      2.6 肽体内(动物试验)抑制JEV活性的研究  39-41
      2.7 数据分析  41
    3 试验结果  41-55
      3.1 肽的鉴定  41
      3.2 荧光显微镜检术显示肽穿过细胞膜并分布于整个细胞质  41-42
      3.3 肽体外对JEV的抑制  42-49
      3.4 肽体内抗病毒效果  49-52
      3.5 讨论  52-55
    参考文献  55-58
致谢  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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