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栖热菌噬菌体TSP4基因组解析及其解旋酶表达
作 者: 李秋鹏
导 师: 林连兵
学 校: 昆明理工大学
专 业: 微生物学
关键词: 栖热菌 长尾噬菌体 基因组解析 解旋酶 克隆表达
分类号: Q939.48
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
噬菌体是感染细菌、古菌及真菌等微生物的病毒,它是地球上最丰富最多样的生命形式,能对微生物世界产生重大影响。栖热菌作为研究高温菌的模式生物,其噬菌体的研究也日益受到人们的重视。目前发现一共有4个科的噬菌体能感染栖热菌,它们分别是肌尾噬菌体(Myoviridae)、长尾噬菌体(Siphoviridae)、复盖噬菌体(Tectiviridae)和丝状噬菌体(Inoviridae)。目前仅有5株栖热菌噬菌体基因组完成了测序。本文腾冲热海热泉分离获得一株长尾科栖热菌噬菌体TSP4为典型长尾噬菌体,其头部直径为67 nm的多面体结构,尾管长度为837 nm,直径为10 nm,柔韧易于弯曲,末端有尾板结构,头部和尾管相连接的尾领处有一定的收缩。对其基因组测序和解析表明,噬菌体TSP4基因组为环状DNA,全长为83142bp,C+G含量为56.0%。通过预测,噬菌体TSP4有37个反向重复序列,18个串联重复序列,150个启动子,36个大于200 bp的GC岛。噬菌体TSP4和宿主菌使用遗传密码子都具有非常明显的偏嗜性,但两者的偏嗜性显著不同。TSP4噬菌体一共预测出108个可能的编码基因,其中编码基因分为两大簇,一簇为逆时针,一簇为顺时针。逆时针的一簇主要为噬菌体的DNA代谢、复制、重组、转录相关蛋白,顺时针一簇主要是噬菌体的结构衣壳蛋白。TSP4的基因组特征和分离自远东堪察加半岛的栖热菌长尾科噬菌体Siphoviruses P23-45和P74-26具有很高的相似性。此外,论文对TSP4噬菌体的ORF 4、7、11、26、39、42对应的重要功能蛋白进行系统发育及蛋白保守区域分析,并对其部分蛋白进行了三维结构预测,探索TSP4和其它细菌及噬菌体的亲缘关系。最后,论文对TSP4的helicase DnaB基因进行了重组异源表达,并通过放射性同位素标记法和原子力显微镜直接电镜观察法验证了重组解旋酶的解旋活性。本文在研究腾冲热海栖热菌高温噬菌体多样性的基础上,进一步研究栖热菌高温噬菌体基因组生物学特征,并对噬菌体DNA复制的重要酶类解旋酶进行克隆原核表达,其研究结果将有助于阐明噬菌体进化规律、物种间基因转移的机制,同时也为开发应用独特的高温噬菌体基因资源奠定基础。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-12 图表清单 12-15 第一章 序言 15-34 1.1 栖热菌(Thermus)的基本特征 15-17 1.2 栖热菌的地理分布及分类 17-19 1.3 栖热菌的高温噬菌体 19-24 1.3.1 长尾噬菌体科(Spihoviuse) 20-21 1.3.2 肌尾噬菌体科(Myoviridae) 21-22 1.3.3 丝状噬菌体科(Inoviridae) 22-23 1.3.4 覆盖层噬菌体科(Tectiviridae) 23-24 1.4 栖热菌噬菌体基因组 24-29 1.4.1 ΦYS40基因组特征 24-26 1.4.2 P23-45和P74-26基因组特征 26-27 1.4.3 ΦIN93基因组特征 27-28 1.4.4 P23-77基因组特征 28-29 1.4.5 栖热菌噬菌体主要功能蛋白研究进展 29 1.5 解旋酶 29-32 1.5.1 解旋酶概述 29-30 1.5.2 解旋酶活性测定方法 30-31 1.5.3 噬菌体解旋酶的研究进展 31-32 1.6 研究目的和意义 32-34 第二章 TSP4噬菌体的分离及其基因组的提取测序 34-37 2.1 材料 34 2.2 方法 34-35 2.2.1 宿主菌栖热菌的培养 34-35 2.2.2 TSP4噬菌体的培养 35 2.2.3 TSP4噬菌体基因组的提取 35 2.2.4 TSP4噬菌体基因组的测序拼接 35 2.3 结果与讨论 35-37 第三章 TSP4噬菌体基因组的解析 37-85 3.1 材料 37 3.2 方法 37-39 3.2.1 开放阅读框(open reading frame,ORF)的预测 37 3.2.2 可能基因的预测和tRNA编码序列的分析 37 3.2.3 假定基因编码产物在NCBI数据库中的同源性检索 37-38 3.2.4 基因编码产物的多重序列对比分析和系统发生树的绘制 38 3.2.5 基因组一般特性分析 38 3.2.6 基因组上重复序列和转录终止子的分析 38-39 3.2.7 基因组上启动子的预测 39 3.2.8 基因组上GC岛的分析 39 3.2.9 使用遗传密码子的偏嗜性(codon usage bias)分析 39 3.3 结果 39-83 3.3.1 基因组中ORFs的预测和可能的编码基因序列结果 39-40 3.3.2 TSP4噬菌体基因组概述 40-58 3.3.3 TSP4噬菌体基因组ORF的序列分析 58-61 3.3.5 TSP4噬菌体部分蛋白结构和功能的预测 61-83 3.4 讨论 83-85 第四章 TSP4噬菌体解旋酶tsp4-h42基因的克隆表达 85-101 4.1 材料 85 4.1.1 细菌和质粒 85 4.1.2 培养基 85 4.2 方法 85-94 4.2.1 引物的合成 85-86 4.2.2 引物稀释 86 4.2.3 PCR扩增目的片段 86 4.2.4 PCR产物的胶回收 86 4.2.5 感受态细胞的制作 86-87 4.2.6 表达载体的构建 87-91 4.2.7 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 91 4.2.8 SDS-PAGE检测 91 4.2.9 重组解旋酶蛋白的纯化 91-92 4.2.10 重组解旋酶蛋白的ATP酶酶活的测定 92 4.2.11 重组解旋酶蛋白的解旋酶酶活的测定 92-94 4.3 结果 94-99 4.3.1 重组解旋酶tsp4-h42基因克隆结果 94-95 4.3.2 重组解旋酶tsp4-h42基因的表达 95 4.3.3 重组解旋酶tsp4-h42 ATP酶活的测定 95-97 4.3.4 重组解旋酶tsp4-h42解旋酶活性的测定 97-99 4.4 讨论 99-101 第五章 总结与展望 101-103 致谢 103-104 参考文献 104-108 附录A Sequence similarity and predicted molecular function for geneproducts of TSP4 and P23-45 108-118 附录B TSP4基因组启动子序列聚类分析 118-123 附录C 攻读硕士期间发表论文目录 123-124 附录D 实验药品与设备 124-128 D.1主要溶液及其配制 124-127 D.1.1醋酸钠(NaAc)溶液:3 M,pH 5.2 124 D.1.2 TE缓冲液:pH8.0 124 D.1.3 TAE电泳缓冲液 124 D.1.4 CaCl_2溶液:1 mol/L 124 D.1.5 甘油溶液 124 D.1.6 SOC培养基 124-125 D.1.7 CTAB抽提液 125 D.1.8 CTAB/NaCl溶液 125 D.1.9 溴化乙锭溶液 125 D.1.10 1%琼脂糖凝胶的配制 125 D.1.11 2×SDS-PAGE加样缓冲液 125-126 D.1.12 SDS-PAGE电泳阴极缓冲液 126 D.1.13 SDS-PAGE 5%浓缩胶 126 D.1.14 SDS-PAGE 10%分离胶 126 D.1.15 SDS-PAGE电泳阳极缓冲液 126 D.1.16 脱色液 126-127 D.1.17 染色液 127 D.1.18 电转移缓冲液 127 D.2 主要仪器 127-128 D.3 试剂及酶制品 128
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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学(系统微生物学) > 病毒(滤过性病毒) > 噬菌体(细菌病毒)
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