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犬瘟热ELISA检测方法的建立及临床应用

作　者: 崔金鑫
导　师: 范红结；王永山
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬瘟热病毒夹心ELISA 间接ELISA 检测
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、鼬鼠科及部分浣熊科的一种急性、高度接触性、致死性传染病。该病在全世界范围内普遍发生,我国是该病的多发地区。近年来,报道显示CDV的感染宿主范围不断扩大,部分地区还出现了非典型症状的病例。虽然该病已有疫苗在使用,但并不能阻止该病在一些地区的爆发趋势。因此,快速而有效的检测方法是防控该病的关键。酶联免疫吸附试验(ELISA)作为一种特异性强、敏感度高、操作简便的检测技术,在CDV的检测上,有着很好的应用前景。本研究在实验室已有的研究基础上,建立了基于单克隆抗体的夹心ELISA检测方法和基于杆状病毒表达的重组CDVN蛋白的间接ELISA检测方法,以用于CDV抗原和抗体的检测。试验内容包括：实验1：犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及临床应用本实验建立了检测犬瘟热病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法：以纯化的犬瘟热病毒(CDV)单抗1D9作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗1E7作为检测抗体,反应条件为：捕获抗体的包被浓度为2.4μg/mL,酶标单抗1E7的稀释度为1：4000,封闭液采用10%小牛血清。特异性试验结果显示,该单抗夹心ELISA方法与犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV),犬腺病毒1型(CAV-1)和犬冠状病毒(CCV)等无交叉反应；敏感性试验结果显示,该方法检测CDV病毒量的最低限为102TCID50/mL;重复性试验结果表明,该方法批内、批间变异系数小于10%；用此方法对80份临床样品进行检测,并与RT-PCR检测方法的检测结果进行对比,检出符合率为90%。本实验所建立的单抗夹心ELISA检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,为犬瘟热(CD)的临床诊断提供了一种有效的方法。实验2：犬瘟热病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及临床应用用杆状病毒表达的重组CDVN蛋白作为包被抗原,建立了检测CDV血清抗体的间接ELISA方法。优化反应条件的结果为：抗原包被浓度为4.75ug/ml;包被条件为4℃过夜；封闭液为10%小牛血清；血清的稀释度为100倍；酶标抗体稀释度为2000倍,作用时间为37℃下1h；阴阳性临界值判定标准为0.148；标准阳性血清稀释到3200倍仍可以检测出；重复性试验结果表明,该方法批内、批间变异系数小于10%；用此方法对临床上128份血清样品进行检测,并与商品化ELISA试剂盒检测结果相比较,检出符合率为93.8%。本实验所建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性和稳定性,可用于犬瘟热(CD)的临床诊断。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一篇文献综述犬癌热病毒检测技术研究进展  11-23
  1 犬瘟热病原特性  11-12
  2 犬瘟热病毒检测技术  12-19
    2.1 病原学检测方法  13-14
    2.2 血清学检测方法  14-17
    2.3 分子生物学检测方法  17-19
  参考文献  19-23
第二篇试验研究  23-51
  第一章犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及临床应用  23-35
    摘要  23-24
    1 材料与方法  24-27
      1.1 病毒和细胞  24
      1.2 主要试剂  24
      1.3 包被单抗和酶标单抗的制备  24-25
      1.4 单抗夹心ELISA方法最佳工作条件的确定  25-26
      1.5 单抗夹心ELISA阳性临界值的确定  26
      1.6 特异性试验  26
      1.7 敏感性试验  26
      1.8 重复性试验  26
      1.9 对临床样品的检测  26-27
    2 结果  27-32
      2.1 单抗夹心ELISA方法最佳工作条件的确定  27-29
      2.2 单抗夹心ELISA检测方法操作程序的确定  29
      2.3 单抗夹心ELISA阳性临界值的确定  29
      2.4 特异性试验  29-30
      2.5 敏感性试验  30
      2.6 重复性试验  30-31
      2.7 对临床样品的检测  31-32
    3 讨论  32-33
    Abstract  33-34
    参考文献  34-35
  第二章犬瘟热病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及临床应用  35-51
    摘要  35
    1 材料与方法  35-38
      1.1 病毒、血清和细胞  35-36
      1.2 主要试剂  36
      1.3 抗原的制备  36-37
      1.4 间接ELISA检测方法最佳工作条件的确定  37
      1.5 间接ELISA检测方法结果的判定  37-38
      1.6 敏感性试验  38
      1.7 稳定性试验  38
      1.8 对临床样品的检测  38
    2 结果  38-47
      2.1 抗原的制备  38-42
      2.2 间接ELISA检测方法最佳工作条件的确定  42-44
      2.3 间接ELISA检测方法操作程序的确定  44-45
      2.4 间接ELISA检测方法结果的判定  45
      2.5 敏感性试验  45
      2.6 重复性试验  45-46
      2.7 对临床样品的检测  46-47
    3 讨论  47-48
    Abstract  48-49
    参考文献  49-51
全文总结  51-53
附录：常用试剂的配制  53-57
致谢  57

犬瘟热ELISA检测方法的建立及临床应用

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