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NSK三肽对日本脑炎病毒抑制活性的研究

作　者: 于亚玲
导　师: 茅翔
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本脑炎病毒 NSK三肽蛋白表达和纯化体内(外)试验
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

日本脑炎(Janpanese encephalitis,JE)又称流行性日本脑炎(简称乙脑)是由日本脑炎病毒引起的一种严重危害人畜健康的中枢神经系统疾病。日本脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属,与西尼罗病毒、登革热病毒同属。该病不但影响畜牧业尤其是养猪业的发展,而且对人类的健康造成了极大的危害。随着分子生物学技术的发展,具有广谱的抗菌、抗病毒等多种生物活性作用的抗病毒肽逐渐成为开发这类药物的极具潜力的药品之一。病毒在活细胞内的增殖可分为五个环节,即吸附、穿入、脱壳、生物合成、成熟组装与释放。阻断病毒感染过程任一环节的药物均可成为抗病毒药物。E蛋白是乙脑病毒的囊膜蛋白和成熟病毒粒子表面的结构蛋白,可与细胞膜受体相结合从而与细胞膜融合促使病毒进入细胞的主要蛋白,研究表明其与病毒的吸附和入胞有关。抗病毒肽的作用机理一就是与细胞膜表面的一些受体结合从而达到抗病毒的作用。EDIII loop3抗病毒肽就是通过阻断病毒体表面位点与细胞表面的受体结合达到抗病毒作用。本研究在EDIII loop3抗病毒肽基础上进行筛选得到抗日本脑炎病毒的三肽。研究的主要内容如下：一、实验室通过对EDIII loop3抗病毒肽第363-369位氨基酸通过点突变的方法进行改造,测序正确,将质粒转化Rosetta2大肠杆菌表达蛋白,亲合层析和分子筛纯化蛋白,通过Western Blot检测,结果表明纯化得到目的蛋白。二、BHK-21细胞的培养,JEV扩增,TCID50测定病毒滴度。通过LDH法测定纯化的蛋白对于细胞的最大毒性浓度,蚀斑方法检测突变后EDIII loop3蛋白对日本脑炎病毒的抑制效果。结果表明N、S、K三个氨基酸在EDIII抗日本脑炎病毒中其重要作用。三、利用不同浓度的NSK三肽作用BHK-21细胞后,进行接种日本脑炎病毒,利用蚀斑试验、实时荧光定量PCR和Western blot检测,证明NSK三肽对日本脑炎病毒的抑制效果显著,实验表明NSK三肽在浓度为1000M抑制效果极为显著,并具有剂量依赖性和序列依赖性。四、通过对小鼠脑部注射抗病毒肽和腹腔注射抗病毒肽,然后攻日本脑炎病毒,对小鼠的精神状态及死亡数量进行记录和分析。结果表明,脑部注射抗病毒肽对日本脑炎的预防试验中小鼠的保护率高,第5天保护率达到90%,第7天保护率维持到70%,第21天保护率仍维持在70%。以上实验表明筛选得到的抗病毒NSK三肽具有较好的抑制日本脑炎病毒感染的效果。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
英文縮写词表  11-12
文献综述  12-30
  第一章抗病毒肽对日本脑炎病毒抑制活性的研究  12-30
    1 日本脑炎病毒的结构和分子生物学特性  12-14
      1.1 日本脑炎病毒的结构  13
      1.2 日本脑炎病毒的分子生物学特性  13-14
    2 日本脑炎病毒蛋白的结构和功能  14-20
      2.1 日本脑炎病毒结构蛋白  14-18
      2.2 日本脑炎病毒的非结构蛋白  18-20
    3 抗病毒肽的研究进展  20-23
      3.1 抗病毒肽的发现  20-21
      3.2 抗菌肽的抗病毒作用机制  21-23
    参考文献  23-30
实验部分  30-84
  第二章抗病毒三肽NSK的筛选  30-56
    摘要  30-31
    1 材料  31-33
      1.1 毒(菌)株、质粒和细胞  31
      1.2 主要试剂  31
      1.3 主要仪器设备  31-32
      1.4 溶液的配制  32-33
    2 EDⅢ突变体蛋白质粒的构建和蛋白的纯化  33-40
      2.1 EDⅢloop3非A氨基酸点突变引物设计  33-35
      2.2 EDⅢloop3突变体质粒的构建  35-37
      2.3 EDⅢ及突变体蛋白的纯化  37-40
    3 EDⅢ及突变体蛋白抗日本脑炎病毒活性的检测  40-45
      3.1 细胞的复苏和培养  40-41
      3.2 扩增病毒和病毒滴度的测定  41-42
      3.3 EDⅢ蛋白及突变体蛋白在BHK-21细胞上的细胞毒性的测定  42-44
      3.4 EDⅢ蛋白及突变体蛋白抗病毒活性的检测  44-45
    4 结果与分析  45-52
      4.1 EDⅢloop3突变体蛋白小量诱导结果分析  45-47
      4.2 EDⅢ蛋白和突变体蛋白的纯化  47-48
      4.3 Western blot鉴定  48-49
      4.4 细胞毒性试验结果分析  49-50
      4.5 蚀斑试验检测EDⅢ蛋白及突变体蛋白抗病毒活性  50-52
    5 讨论  52-54
    参考文献  54-55
    Abstrat  55-56
  第三章 NSK三肽体外抗日本脑炎病毒的活性实验  56-76
    摘要  56
    1 材料  56-58
      1.1 细胞和毒株  56
      1.2 主要试剂  56-57
      1.3 主要仪器设备  57
      1.4 溶液的配制  57-58
    2 NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性实验  58-63
      2.1 NSK三肽在BHK-21细胞上细胞毒性的测定  58-59
      2.2 蚀斑试验检测NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性  59-60
      2.3 Q-PCR检测NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性  60-62
      2.4 Western blot检测NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性  62-63
    3 NSK三肽抑制日本脑炎病毒吸附BHK-21细胞的影响  63-66
      3.1 不同浓度NSK作用细胞  63-64
      3.2 提取RNA  64
      3.3 反转录PCR  64
      3.4 实时荧光定量PCR  64-66
    4 结果和分析  66-72
      4.1 细胞毒性试验结果分析  66-67
      4.2 蚀斑试验检测NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性  67-68
      4.3 Q-PCR检测NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性  68-69
      4.4 Western blot检测NSK三肽抗日本脑炎病毒感染的活性  69-71
      4.5 NSK三肽抑制日本脑炎病毒对细胞的吸附  71-72
    5 讨论  72-73
    参考文献  73-74
    Abstract  74-76
  第四章 NSK三肽体内抗日本脑炎病毒的活性实验  76-84
    摘要  76
    1 材料  76-77
      1.1 实验动物和毒株  76
      1.2 主要试剂  76-77
      1.3 主要仪器设备  77
      1.4 溶液的配制  77
    2 NSK三肽对日本脑炎病毒感染小鼠体内活性实验  77-79
      2.1 试验用病毒半数致死量的测定  77-78
      2.2 脑部注射NSK三肽对小鼠保护实验  78
      2.3 腹腔注射NSK三肽对小鼠保护实验  78-79
    3 结果和分析  79-81
    4 讨论  81-82
    参考文献  82-83
    Abstrat  83-84
全文总结  84-86
发表论文及专利  86-88
致谢  88

NSK三肽对日本脑炎病毒抑制活性的研究

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