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Pseudidiomarina homiensis ZJCN121岩藻多糖酶生产、固定化和酶学性质研究

作　者: 单瑞芬
导　师: 蔡敬民
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 假海源菌 岩藻多糖酶 响应面实验 液态发酵 固定化
分类号: Q814.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 26次
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内容摘要


本文对我国浙江苍南海域采集的样品（包括海水，海泥，礁石，海藻，腐木，海贝），采用平板稀释法分离海洋细菌，共分离得到细菌66株。以岩藻多糖为唯一碳源，经过初筛和复筛得到5株产岩藻多糖酶细菌，占所筛细菌总数的7.58%；从腐木中分离出产岩藻多糖酶细菌所占比例最高，为25%。其中菌株ZJCN121的岩藻多糖酶产量最高，酶活力为0.71IU/mL，且发酵性能较稳定，被确定为下一步研究对象。本文考察了菌株ZJCN121形态特征和生理生化特征，并测定了其16S rDNA序列，与GeneBank获取的序列比对，其与Pseudidiomarina homiensis PO-M2同源性达98%。由于菌株ZJCN121的形态特征和生理生化特征与Pseudidiomarina homiensis PO-M2的部分不同，因此认为菌株ZJCN121是霍米海角假海源菌（Pseudidiomarina homiensis）的变种。为了提高岩藻多糖酶产量，对细菌ZJCN121培养基组分和发酵条件进行优化。首先通过单因素试验确定了最佳碳源为复合碳源（麸皮+葡萄糖），最佳氮源为NH4NO3，岩藻多糖浓度为0.59g/L；其次通过Plackett-Burman法在8个因素中确定出对产岩藻多糖酶的主要影响因素为麸皮、NaCl和岩藻多糖，利用最陡爬坡试验逼近最大响应区域，最后设计Box-Behnken中心组合试验确定出培养基最佳组分：麸皮2.7g/L，NaCl31.25g/L，岩藻多糖0.59g/L。同时对细菌ZJCN121发酵条件也进行了优化，实验结果表明：当起始pH为6.5，接种量为2%，装液量为100mL/250mL时，在20℃培养24h，岩藻多糖酶活力达到最高，为1.19IU/mL。采用壳聚糖、凹凸棒石和D101-I树脂三种固定化材料对岩藻多糖酶进行固定化，实验结果表明壳聚糖的固定效果好于其它二种载体；研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对岩藻多糖酶的最佳固定化条件，将1g壳聚糖载体加入到浓度为1.5%戊二醛中交联2h后，给酶量为22IU，在吸附固定化温度为40℃，转数为40r/min条件下，吸附固定4h后，固定化酶酶活力为2.43IU/g。对固定化酶和游离酶酶学性质也进行了研究，实验结果表明固定化酶最适反应温度为55℃，游离酶为50℃；固定化酶半失活温度为69℃，游离酶为62℃；固定化酶最适反应pH为7.0，游离酶为6.5；固定化酶和游离酶在pH为6.0-7.0的范围内较稳定；Fe2+、Cu2+和Mn2+对岩藻多糖酶活力有抑制作用，Ca2+对酶活力有促进作用；固定化酶Km值为7.48mg/mL，Vmax为3.19g（/L·min），游离酶Km值为5.44mg/mL，Vmax为5.94g/（L·min）。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
文献综述  8-14
1 引言  14-15
  1.1 研究价值和意义  14
  1.2 本研究解决的问题  14-15
2 材料与方法  15-25
  2.1 材料  15-16
    2.1.1 菌种  15
    2.1.2 培养基  15
    2.1.3 培养条件  15
    2.1.4 仪器和试剂  15-16
    2.1.5 试剂的配制  16
  2.2 方法  16-25
    2.2.1 岩藻糖标准曲线的绘制  16-17
    2.2.2 岩藻多糖酶活力的测定  17-18
    2.2.3 蛋白质含量的测定[63]  18
    2.2.4 产岩藻多糖酶细菌的筛选  18
    2.2.5 细菌ZJCN121 菌株鉴定  18-19
    2.2.6 细菌ZJCN121 产岩藻多糖酶液态发酵培养基优化  19-21
    2.2.7 细菌ZJCN121 产岩藻多糖酶液态发酵条件优化  21-22
    2.2.8 岩藻多糖酶固定化的研究  22-23
    2.2.9 岩藻多糖酶酶学性质的研究  23-25
3 结果与分析  25-50
  3.1 产岩藻多糖酶细菌的筛选  25
  3.2 细菌ZJCN121 菌株鉴定  25-28
    3.2.1 形态学观察  25
    3.2.2 生理生化特征  25-26
    3.2.3 16S rDNA分子鉴定  26-28
  3.3 细菌ZJCN121 产岩藻多糖酶液态发酵培养基优化  28-36
    3.3.1 不同碳源对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  28-29
    3.3.2 复合碳源浓度和比例对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  29-30
    3.3.3 不同氮源对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  30
    3.3.4 氮源浓度对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  30-31
    3.3.5 诱导物对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  31
    3.3.6 培养介质对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  31-32
    3.3.7 Plackett-Burman设计筛选影响产岩藻多糖酶因素  32
    3.3.8 最陡爬坡试验  32-33
    3.3.9 响应面法优化发酵培养基  33-36
  3.4 细菌ZJCN121 产岩藻多糖酶液态发酵条件优化  36-39
    3.4.1 起始pH对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  36-37
    3.4.2 装液量对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  37
    3.4.3 发酵温度对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  37-38
    3.4.4 发酵时间对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  38-39
    3.4.5 接种量对ZJCN121 产岩藻多糖酶的影响  39
  3.5 岩藻多糖酶固定化的研究  39-45
    3.5.1 岩藻多糖酶固定化载体的选择  39-42
    3.5.2 壳聚糖固定岩藻多糖酶条件的优化  42-45
  3.6 岩藻多糖酶酶学性质的研究  45-50
    3.6.1 岩藻多糖酶的最适反应温度  45-46
    3.6.2 岩藻多糖酶的热稳定性  46-47
    3.6.3 岩藻多糖酶的最适反应pH  47
    3.6.4 岩藻多糖酶的pH稳定性  47-48
    3.6.5 金属离子对岩藻多糖酶活力的影响  48
    3.6.6 岩藻多糖酶的动力学研究  48-50
4 讨论  50-52
  4.1 岩藻多糖酶产生菌的筛选  50
  4.2 细菌ZJCN121 菌株鉴定  50
  4.3 细菌ZJCN121 的发酵条件优化  50
  4.4 岩藻多糖酶固定化载体的选择  50-51
  4.5 壳聚糖固定岩藻多糖酶对酶活力的影响  51-52
5 结论  52-53
  5.1 细菌 ZJCN121 菌株鉴定  52
  5.2 细菌 ZJCN121 产岩藻多糖酶液态发酵优化  52
  5.3 岩藻多糖酶固定化的研究  52-53
参考文献  53-58
致谢  58-59
作者简介  59
在读期间发表的学术论文  59

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程 > 固定化酶和固定化细胞技术
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