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葛根素微生物糖基化作用小试及固定化酶研究

作　者: 黄国栋
导　师: 袁生
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 葛根素葛根素-7-O-葡萄糖苷葛根素-7-O-果糖苷固定化酶双柱串联 DEAE-纤维素
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

葛根素(puerarin),4’,7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮(8-C-β-D-Glucopyranosyl-7,4’-hydroxy-Isoflavone),目前在临床上广泛应用于心脑血管系统疾病、糖尿病、急性酒精中毒及肿瘤等疾病的治疗,但是存在水溶解度低和生物利用度低等缺点。对葛根素结构进行修饰改造,改善其水溶性和脂溶性,提高其生物利用度及选择性,最终增强其药理活性,是当前葛根素研究的热点。本实验室丁娟芳和蒋洁蓉等人筛选得到一株氧化微杆菌Microbacterium oxydans CGMCC 1788,通过该菌的静息细胞及细胞提取液转化可以将葛根素转化为葛根素-7-O-葡萄糖苷。丁娟芳结合多种蛋白纯化方法从该菌中分离纯化得到葛根素糖基化酶,并研究了其酶学性质。于赐刚利用乙醇渗透化处理该菌细胞,发现可将葛根素转化为葛根素-7-O-果糖苷。本文采用正交设计法优化了工业培养基,利用5 L发酵罐培养氧化微杆菌,细胞经乙醇渗透化处理2h,大量制备葛根素-7-O-果糖苷。采用双柱串联层析系统分离纯化葛根素-7-O-果糖苷,以10%乙醇作为洗脱液,10mL/min流速洗脱,收集液经浓缩干燥,最终得到了葛根素-7-O-果糖苷晶体3.84 g,HPLC检测纯度达97%。本文比较了DEAE-纤维素、CM-纤维素对葛根素糖基化酶的固定效果,结果表明DEAE-纤维素固定化载体的酶活高出CM-纤维素固定化载体3.6倍,由此选定DEAE-纤维素作为固定化载体。本文也尝试了DEAE-纤维素的戊二醛交联固定化技术,结果表明交联载体经0.5mol/L的NaCl溶液解吸后,酶活损失率为85%左右,未达到固定化目的。以DEAE-纤维素为载体,通过传统的离子吸附法固定化葛根素糖基化酶,从加酶量、吸附pH方面分析考察对固定化的影响,确定最佳固定化条件为：0.5gDEAE-纤维素,加酶量为12mg/g DEAE-纤维素,吸附pH为8.0。固定化载体酶活为1.2U,活力回收率达到54.8%。本文从温度、pH及稳定性等方面研究了固定化酶的性质,确定了固定化酶的最适反应温度为30℃,与游离酶一致；最适反应pH为6.5,相比游离酶往酸性偏移；20℃-40℃范围内热稳定性良好,对比游离酶热稳定性并未大幅拓宽；pH4.5-8.5范围内保持较高酶活,相比游离酶pH稳定性显著提升；连续操作10代后残余酶活仍保持在50%左右,保存55天后活力下降到初始酶活的45%,初步表明具备工业化应用潜力。

葛根素微生物糖基化作用小试及固定化酶研究

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