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日本七鳃鳗Vav3基因克隆、表达及多克隆抗体制备研究

作　者: 冯波
导　师: 李庆伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 日本七鳃鳗 Vav3 适应性免疫起源和进化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

Vav3是在生物体内广泛表达的一种Rho家族GTPase的鸟嘌呤核苷酸转移因子,在进化上高度保守,能够通过调节Rho家族不同成员的活性参与多条T、B细胞信号通路的调控,并在细胞增殖、分化和免疫功能的调节方面发挥重要作用。七鳃鳗作为现存最古老的无颌类脊椎动物,拥有其独特的适应性免疫系统,是研究脊椎动物适应性免疫系统起源与进化的模式生物。目前,对于Vav3的研究大多集中于高等脊椎动物,七鳃鳗中是否存在Vav3尚不清楚。本论文运用生物信息学和分子生物学方法,从日本七鳃鳗白细胞cDNA文库中搜索到一条能够表达Vav3的EST序列。对其进行基因克隆、表达及生物信息学分析,有助于阐明脊椎动物Vav3基因的起源与进化。抗体的制备为进一步研究七鳃鳗适应性免疫机制及脊椎动物适应性免疫系统的起源提供了材料。本研究通过对本实验室构建的日本七鳃鳗白细胞cDNA3,000多条有效EST序列进行生物信息学分析,筛选得到能够翻译Vav3的核苷酸序列。通过RACE方法成功获得cDNA全长序列,共2,866bp,其中编码区2,511bp,编码837个氨基酸,理论分子量92.07kD。通过一级序列分析、比对和高级结构预测,表明七鳃鳗Vav3具有典型的3个酪氨酸磷酸化位点,与其他物种具有较高的同源性。为了进一步阐明七鳃鳗Vav3与其他脊椎动物Vav3的亲缘关系,通过邻接法构建系统发育树,发现七鳃鳗Vav3进化地位比较低,符合生物由低等到高等的客观自然进化规律。利用基因工程手段,以GAPDH基因作为内参,设计特异性引物,Real-time PCR法检测Vav3基因在七鳃鳗心脏、白细胞、肝脏、肠、鳃、肾脏和脂肪小体中的相对表达量。发现Vav3在各个组织中广泛表达,进一步经脂多糖(LPS)刺激后,发现其在脂肪小体、鳃和白细胞中的表达量显著上调。以上结果说明,七鳃鳗Vav3参与类淋巴细胞免疫应答,在对病原菌的防御反应中也发挥重要作用。进一步构建pET-32a-Vav3原核表达载体,并在E.coli BL21中进行表达,得到可溶性表达的重组蛋白。组氨酸亲和层析柱纯化,获得七鳃鳗Vav3重组蛋白纯品。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备兔抗七鳃鳗Vav3多克隆抗体。流式细胞术检测七鳃鳗Vav3在白细胞中的表达量,结果显示Vav3能够在白细胞中表达,进一步证明Vav3在七鳃鳗免疫应答中发挥重要作用。综上所述,Vav3蛋白能够在无颌类脊椎动物中表达。对其功能的推测为无颌类脊椎动物适应性免疫应答机制及脊椎动物适应性免疫应答的起源提供了重要线索。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第1章绪论  10-17
  1.1 Vav3的结构  10-11
  1.2 Vav3的活化机制  11-12
  1.3 Vav3在T、B淋巴细胞信号通路中的作用  12-13
    1.3.1 Vav3在CD5诱导的信号通路中的作用  12
    1.3.2 Vav3在MAPK信号通路中的作用  12
    1.3.3 Vav3在P13K/Akt-1信号通路中的作用  12-13
    1.3.4 Vav3调节JNK信号通路  13
    1.3.5 Vav3参与NF-κB依赖的转录  13
  1.4 Vav3在T、B细胞发育中的作用  13
  1.5 Vav3在固有免疫中的作用  13-14
  1.6 Vav3在肿瘤中的作用  14
    1.6.1 Vav3在乳腺癌中的作用  14
    1.6.2 Vav3在前列腺癌中的作用  14
  1.7 Vav3的其他生物学功能  14-15
    1.7.1 Vav3在组织再生中的作用  14-15
    1.7.2 Vav3在血管生成中的作用  15
    1.7.3 Vav3在细胞增殖和迁移中的作用  15
    1.7.4 Vav3在细胞形态和粘附中的作用  15
  1.8 小结  15-17
第2章七鳃鳗Vav3基因的分子克隆及生物信息学分析  17-31
  2.1 七鳃鳗白细胞Vav3基因的分子克隆  17-23
    2.1.1 材料  17
    2.1.2 方法  17-21
    2.1.3 结果  21-23
  2.2 七鳃鳗Vav3蛋白氨基酸序列生物信息分析  23-29
    2.2.1 数据库和软件  23
    2.2.2 二级结构域预测  23
    2.2.3 三级结构模拟  23
    2.2.4 同源序列比对  23
    2.2.5 系统进化树构建  23
    2.2.6 结果  23-29
  2.3 讨论  29-30
  2.4 小结  30-31
第3章七鳃鳗Vav3基因表达、蛋白纯化  31-43
  3.1 实时荧光定量PCR法检测Vav3的表达  31-34
    3.1.1 材料  31
    3.1.2 方法  31-34
    3.1.3 结果  34
  3.2 七鳃鳗Vav3基因原核表达及重组蛋白纯化  34-42
    3.2.1 材料  34-35
    3.2.2 方法  35-40
    3.2.3 结果  40-42
  3.3 讨论  42
  3.4 小结  42-43
第4章兔抗七鳃鳗Vav3多克隆抗体制备及鉴定  43-53
  4.1 材料和方法  43-49
    4.1.1 材料  43
    4.1.2 方法  43-49
  4.2 结果  49-51
    4.2.1 兔抗七鳃鳗Vav3多克隆抗体的制备和效价测定  49
    4.2.2 兔抗七鳃鳗Vav3多克隆抗体的特异性测定  49-51
    4.2.3 流式细胞术检测Vav3在七鳃鳗白细胞内表达  51
  4.3 讨论  51-52
  4.4 小结  52-53
结论  53-54
本论文创新点  54-55
参考文献  55-58
附录A 脊椎动物不同物种Vav3的FASTA格式氨基酸序列  58-67
附录B pET-32a质粒图谱  67-68
附录C 蛋白质浓度测定标准曲线  68-69
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  69-70
致谢  70

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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