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日本七鳃鳗（Lampetra japonica）Lyb基因的克隆及脊椎动物Y-box基因的系统发育分析

作　者: 金萍
导　师: 侯林；马飞
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Y-box基因冷休克结构域基因家族进化系统发育分析日本七鳃鳗
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

七鳃鳗作为现存最古老的脊椎动物是联系无脊椎动物与脊椎动物之间的重要物种,从遗传信息基础来看,它必定印记了无脊椎动物的进化历史,在脊椎动物的系统发育分析中有着十分重要的地位。Y-box基因是从细菌到人类都广泛存在的转录调控因子,是一类与高度保守的顺式作用元件CTGA-TTGGCCAA相互作用的负调控因子。它参与转录调节、翻译调控、细胞增殖和再生、mRNA选择性剪接、DNA的修复等。为更进一步揭示脊椎动物Y-box基因家族进化,本文采用RT-PCR和RACE技术,首先以本实验室已获取的日本七鳃鳗唾液腺Y-box基因序列以及本实验室已有的日本七鳃鳗肝脏EST数据为基础,克隆了日本七鳃鳗肝脏中的Y-box基因。进一步通过生物信息学方法,对公共数据库中已经通过实验验证的脊椎动物Y-box蛋白序列以及经过实验验证的日本七鳃鳗Y-box蛋白序列进行系统发育分析,初步阐明了脊椎动物Y-box基因的进化机制。本文的主要研究结果如下:1)以本实验室已有的日本七鳃鳗肝脏EST数据为基础,采用cap3软件对所获得的EST序列进行拼接,获得拼接好的contig序列以及余下的未拼接上的单个片段,然后将所有的contig序列以及未拼接上的单个片段提交到DDBJ数据库上进行blast分析,从中找出与其它物种中Y-box基因相似性高的片段。2)根据预测得到的日本七鳃鳗肝脏中Y-box基因的部分片段设计引物,采用RT-PCR技术以及3’、5’RACE技术,从日本七鳃鳗肝脏中成功克隆出了y-box基因,命名为lyb1,其cDNA全长为1423bp,开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸。3)基于实验室已获得的日本七鳃鳗唾液腺Y-box基因lyb2设计引物,采用RT-PCR技术以及3’、5’RACE技术,从现存最古老的无颌类脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)肝脏中克隆得到了相应的Y-box基因,命名为lyb3,其cDNA全长为726bp,其中开放阅读框为546bp,编码181个氨基酸。4)运用NJ法,对Swiss-Prot数据库中已经经过实验验证的其它物种的Y-box蛋白序列以及本实验获得的日本七鳃鳗的Y-box蛋白序列进行系统发育分析,构建系统进化树,结果发现,Y-box基因的分化发生在有颌类出现以后,在有颌类出现以前只有一种类型,有颌类出现以后, Y-box基因分化成YB1、YB2和CSDA三种类型。从整个进化树也可以看出日本七鳃鳗Y-box基因所在的位置与其物种的进化地位是一致的,即处于脊椎动物最原始的位置。5)根据系统发育树的拓扑结构,将Y-box基因分成3组,即YB1、CSDA和YB2,用MEGA3.1软件分别计算它们的非同义替换速率(dN)和同义替换速率(dS)及其比值(ω)。结果表明,YB1和CSDA的ω值小于1(P<0.01),表示它们受到净化选择压力作用,而YB2的ω则大于1,表示其受到正选择压力作用(P>0.01)。此外,在日本七鳃鳗中,三个Y-box基因也是受到净化选择压力作用(P<0.05)。综上所述,本研究已在现存最原始的脊椎动物日本七鳃鳗中克隆得到的3个Lyb基因,其均包含一个大约由70个氨基酸组成的保守的冷休克结构域,表明日本七鳃鳗的Lyb基因均属于Y-box基因家族。通过对脊椎动物y-box基因的系统发育分析显示,Y-box基因是在进化过程中通过基因复制或选择性剪接来产生直系同源基因与旁系同源基因,进而使Y-box基因家族成为一个多功能的基因家族。通过进化选择压力分析揭示,在复制产生的基因中,除Y-BOX2是受正选择压力作用外,其它家族都是受净化选择压力作用,以保持其原有的结构和功能。本文首次在日本七鳃鳗中对Y-box基因及其进化进行了较为详细地研究,这将为更进一步地深入研究该基因的功能及其基因家族的进化提供了重要基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章引言  11-19
  1.1 冷休克结构域蛋白的结构及作用机理  11-13
    1.1.1 冷休克结构域  12
    1.1.2 C-末端区域  12-13
    1.1.3 N-末端区域  13
  1.2 冷休克结构域蛋白的生物学功能  13-15
    1.2.1 冷休克蛋白的冷适应功能  13-14
    1.2.2 冷休克结构域蛋白的转录调节功能  14
    1.2.3 冷休克结构域蛋白的翻译调控功能  14-15
    1.2.4 冷休克结构域蛋白的生理学功能  15
  1.3 冷休克结构域蛋白的研究进展  15-17
    1.3.1 原核生物冷休克蛋白的研究  15-16
    1.3.2 真核生物冷休克结构域蛋白的研究  16-17
  1.4 日本七鳃鳗简介  17-18
    1.4.1 日本七鳃鳗的生活史  17-18
    1.4.2 七鳃鳗的进化地位  18
  1.5 本研究的目的及意义  18-19
第二章日本七鳃鳗肝脏组织中Y-BOX 基因LY81 的克隆与分析  19-34
  2.1 引言  19
  2.2 材料和方法  19-29
    2.2.1 材料  19-20
    2.2.2 总RNA 的提取  20
    2.2.3 已知序列验证  20-22
    2.2.4 cDNA 3’末端快速扩增反应（3’RACE）  22-23
    2.2.5 cDNA 5’末端快速扩增反应（5’RACE）  23-26
    2.2.6 序列拼接及验证  26-27
    2.2.7 结构分析  27
    2.2.8 表达载体的构建  27-29
  2.3 结果  29-32
    2.3.1 日本七鳃鳗肝脏总RNA  29
    2.3.2 日本七鳃鳗肝脏Ly61 基因及蛋白序列  29-30
    2.3.3 Ly61 蛋白的序列比对及结构域预测  30-31
    2.3.4 结合Ly61 蛋白的系统发育树  31-32
    2.3.5 表达载体的构建  32
  2.4 讨论  32-33
  2.5 结论  33-34
第三章日本七鳃鳗肝脏组织中Y-BOX 基因LY83 的克隆与分析  34-44
  3.1 材料和方法  34-38
    3.1.1 材料  34-35
    3.1.2 cDNA 的获得  35
    3.1.3 Ly63 基因部分序列的获取  35
    3.1.4 cDNA 3’末端快速扩增反应（3’RACE）  35-37
    3.1.5 cDNA5’末端快速扩增反应（5’RACE）  37-38
    3.1.6 序列拼接及开放阅读框的预测  38
    3.1.7 Ly63 蛋白的序列比对及结构分析  38
    3.1.8 Ly63 蛋白的系统发育分析  38
  3.2 结果  38-43
    3.2.1 日本七鳃鳗肝脏Ly63 基因及蛋白序列  38-41
    3.2.2 Ly61 蛋白的序列比对及结构预测  41-42
    3.2.3 结合Ly63 蛋白的系统发育树  42-43
  3.3 讨论  43
  3.4 结论  43-44
第四章脊椎动物Y-BOX 基因的系统发育分析  44-52
  4.1 引言  44
  4.2 材料和方法  44-45
    4.2.1 材料  44
    4.2.2 方法  44-45
  4.3 结果  45-50
    4.3.1 氨基酸结构分析  45
    4.3.2 系统发育分析  45-50
    4.3.3 选择压力分析  50
  4.4 讨论  50-51
  4.5 结论  51-52
第五章全文总结  52-53
参考文献  53-59
发表论文  59-73
致谢  73

日本七鳃鳗（Lampetra japonica）Lyb基因的克隆及脊椎动物Y-box基因的系统发育分析

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