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日本七鳃鳗VLRB基因的克隆、原核表达及单克隆抗体制备的研究

作　者: 李默
导　师: 李庆伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 日本七鳃鳗 无颌类脊椎动物 适应性免疫 可变淋巴受体(VLR)
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


七鳃鳗作为无颌类脊椎动物的代表是脊椎动物的祖先,从进化地位上看它是联系无脊椎动物和脊椎动物的重要物种,它势必在研究脊椎动物的进化过程中起到十分重要的作用。可变淋巴受体VLR作为重要的免疫分子,它的发现为适应性免疫系统的进化提供了重要线索,说明早在无颌类生物体内,便存在着一种类似于人类Ig分子的免疫分子,它作为适应性免疫中的主要免疫受体,能够识别多种异源蛋白并起始免疫应答反应。为了进一步了解七鳃鳗免疫系统的特点及功能,本文将进行VLRB基因克隆、蛋白表达及单克隆抗体的制备,最终获得了VLRB单克隆抗体,为进一步研究七鳃鳗适应性免疫系统做准备。本文的主要研究内容如下:本实验根据Genbank公布的序列,设计两对引物(全长引物和保守区引物),应用反转录—聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),从经免疫刺激的七鳃鳗肝脏中扩增出VLRB完整开放阅读框基因序列(1036bp)和保守区片段序列(252bp),然后连接到pMD-18T载体中,转化大肠杆菌DH5α菌株,最后双酶切鉴定阳性克隆菌。测序结果表明日本七鳃鳗体内的确存在着VLRB基因。通过各类七鳃鳗和盲鳗VLR序列之间的比对分析,可以看出他们不仅具有一定的相似性,还具有一段稳定的保守区。将克隆得到的VLRB基因连接到表达载体pET-32a中,经测序鉴定得到阳性克隆,然后经IPTG诱导在大肠杆菌BL12菌株中表达,最后提取可溶性蛋白并进行纯化。SDS-PAGE检测表明,VLRB基因在大肠杆菌中实现融合表达,获得具有一定生物学活性的蛋白。将得到的纯化蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞,用PEG4000进行细胞融合。用相应抗原包被,进行间接Elisa筛选得到阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法进行3次亚克隆,直至单克隆细胞阳性孔率为100%,挑取单克隆进行扩大培养后液氮冻存。经小鼠腹水制备大量单克隆抗体,采用亲和纯化的方法纯化单克隆。最后进行Western-blotting检测,结果表明得到特异性VLRB抗体。综上所述,本研究获得了大量的七鳃鳗单克隆抗体,抗体的制备为进一步研究七鳃鳗适应性免疫系统提供了关键的实验材料。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-16
  1.1 VLR 简介  9
  1.2 首次发现七鳃鳗的VLR  9-10
  1.3 VLR 的成熟机制  10
  1.4 七鳃鳗VLR 的基本特征  10-14
    1.4.1 VLR 的结构及序列特征  10-13
    1.4.2 VLR 的功能及特点  13-14
  1.5 关于VLR 的起源  14-15
  1.6 讨论  15-16
2 日本七鳃鳗可变淋巴受体VLRB 基因的克隆及序列分析  16-24
  2.1 研究目的及意义  16
  2.2 材料和方法  16-19
    2.2.1 材料  16-17
    2.2.2 方法  17-19
  2.3 结果与分析  19-23
    2.3.1 PCR 扩增结果  19-20
    2.3.2 菌落PCR 鉴定  20
    2.3.3 测序结果  20-21
    2.3.4 VLRB 蛋白序列比对结果与分析  21-22
    2.3.5 VLRB 蛋白结构分析  22-23
  2.4 讨论  23-24
3 七鳃鳗VLRB 基因的原核表达及蛋白纯化  24-30
  3.1 研究目的和意义  24
  3.2 材料和方法  24-25
    3.2.1 材料  24
    3.2.3 方法  24-25
  3.3 结果  25-29
    3.3.1 日本七鳃鳗VLRB 原核表达重组质粒的构建  25-26
    3.3.2 VLRB 的诱导表达及可溶性分析  26-28
    3.3.3 pET32a-VLR 蛋白亲和纯化  28-29
  3.4 讨论  29-30
4 日本七鳃鳗VLRB 单克隆抗体的制备  30-37
  4.1 研究目的和意义  30
  4.2 材料与方法  30-33
    4.2.1 材料  30
    4.2.2 方法  30-33
  4.3 结果与分析  33-35
    4.3.1 小鼠免疫Elisa 检测结果  33
    4.3.2 杂交瘤细胞的融合和筛选  33-34
    4.3.3 单克隆抗体的纯化与Elisa 检测  34-35
    4.3.4 Western-blotting 检测单克隆抗体特异性  35
  4.4 讨论  35-37
5 全文总结  37-38
参考文献  38-40
攻读硕士学位期间发表论文情况  40-41
致谢  41

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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