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日本七鳃鳗组织蛋白酶L的克隆表达及功能分析

作　者: 杨东辉
导　师: 李庆伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 日本七鳃鳗组织蛋白酶L 系统进化分子克隆和表达功能分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

组织蛋白酶L（cathepsin L，CTSL）是溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族的主要成员，由信号肽、前体域和成熟域三部分组成。CTSL具有多样的生物学功能，广泛参与体内蛋白水解，抗原呈递，细胞凋亡，T细胞分选，以及胚胎发育等方面，其表达水平的异常还与多种类型肿瘤的发生，心血管和肾病密切相关。在寄生动物中，CTSL主要在营养摄取、组织入侵、免疫逃逸及组织分化等方面发挥作用。本论文通过基因克隆、5’和3’末端快速扩增实验，成功得到日本七鳃鳗CTSL（Lj-CTSL）的cDNA全长序列（1457bp），其中5’-UTR非编码区104bp，3’-UTR非编码区333bp，开放阅读框1020bp，编码³³⁹个氨基酸。生物信息学分析结果表明，Lj-CTSL氨基酸序列由信号肽（Met¹-Ala18）、前体域(Thr¹9-Glu¹¹⁷)和成熟域(Ala¹¹⁸-Val³³⁹)三部分组成，存在一个潜在的糖基化位点(Asn²²⁶)，6个底物结合位点(Leu186，Met¹87，Ala²⁵⁴，Leu²⁸⁰，Gly²⁸³和Ser³³⁵)，1个由半胱氨酸(Cys¹⁴²)、组氨酸(His²⁸²)和天冬酰胺（Asn306）残基构成的催化口袋。序列比对结果表明Lj-CTSL的氨基酸序列与其它物种的CTSL具有较高的同源性，与非洲爪蟾的同源性高达81.1%，且含有高度保守的ERF/WNIN基序和GNFD基序。此外，系统发育树分析结果表明Lj-CTSL与两栖类非洲爪蟾CTSL的亲缘关系最近，符合生物从低等到高等进化规律，但自己又自成一枝，说明其在进化地位上有它的独特性。半定量RT-PCR检测结果表明Lj-CTSL广泛分布于七鳃鳗的心脏、口腔腺、肾脏、肠、肝脏、鳃和性腺组织，且Lj-CTSL在口腔腺中的表达水平最高，推测Lj-CTSL蛋白可能参与七鳃鳗的营养摄取等生理过程。将Lj-CTSL构建入pTWIN原核表达载体，并成功在E.coli BL21中进行表达，获得可溶性重组蛋白rLj-CTSL。MTT实验结果证实了rLj-CTSL对HUVEC、ECV304和MA三种细胞的增殖均具有抑制作用。鸡胚实验结果表明rLj-CTSL能够抑制鸡胚尿囊膜血管的新生，且具有剂量依赖性。日本七鳃鳗（Lampetra japonica）系圆口纲（Cyclostomata）代表动物，是最低等的无颌类脊椎动物，具有洄游习性。寄生期的七鳃鳗在海水中营半寄生生活，以吸食宿主血肉为食。由于日本七鳃鳗特殊的进化地位和寄生特性，其在世界动物学研究史上一直占据着重要地位。Lj-CTSL的成功克隆和表达，以及功能分析将为研究日本七鳃鳗在物种中的起源和进化做了重要的前期准备，同时也为阐明CTSL在日本七鳃鳗体内的生理功能提供重要线索。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 绪论  9-17
  1.1 CTSL 蛋白的分子结构特点  10-11
    1.1.1 组织蛋白酶 L 的分类  10
    1.1.2 组织蛋白酶 L 的合成及转运  10-11
    1.1.3 组织蛋白酶 L 的激活  11
  1.2 组织蛋白酶 L 的结构  11-12
    1.2.1 组织蛋白酶 L 的一级结构  11
    1.2.2 组织蛋白酶 L 的空间结构  11-12
  1.3 组织蛋白酶 L 在生理和病理活动中的作用  12-14
    1.3.1 组织蛋白酶 L 在生理活动中的作用  12-14
    1.3.2 组织蛋白酶 L 在病理活动中的作用  14
  1.4 组织蛋白酶 L 在寄生动物中的作用  14-15
  1.5 总结与展望  15-17
2 日本七鳃鳗组织蛋白酶 L 基因的分子克隆  17-35
  2.1 材料  17-18
    2.1.1 实验材料  17
    2.1.2 仪器设备  17-18
    2.1.3 药品及试剂  18
  2.2 方法  18-30
    2.2.1 引物设计  18
    2.2.2 口腔腺总 RNA 的提取  18-20
    2.2.3 RT-PCR 扩增  20
    2.2.4 CTSL 片段 cDNA 扩增  20-21
    2.2.5 目的片段的回收  21-22
    2.2.6 目的片段与载体连接及转化  22
    2.2.7 阳性菌落的鉴定  22-23
    2.2.8 重组质粒的提取及测序  23-24
    2.2.9 cDNA5’末端全长快速扩增反应(5’ RACE)  24-27
    2.2.10 cDNA3’末端全长快速扩增反应(3’ RACE)  27-29
    2.2.11 3’RACE 和 5’ RACE 重组质粒的获取和鉴定  29
    2.2.12 3’RACE 实验和 5’ RACE 实验所得的序列拼接  29-30
  2.3 结果  30-33
    2.3.1 口腔腺总 RNA 的提取  30
    2.3.2 日本七鳃鳗组织蛋白酶 L 基因的全长扩增  30-33
  2.4 讨论  33-34
  2.5 小结  34-35
3 Lj-CTSL 编码氨基酸序列生物信息学分析  35-49
  3.1 分析所用的在线网站和软件  35
  3.2 结果  35-46
    3.2.1 一级结构分析  35-39
    3.2.2 功能结构域预测  39-40
    3.2.3 二级结构预测  40-41
    3.2.4 三级结构模拟  41-42
    3.2.5 同源序列比对  42-44
    3.2.6 保守性分析  44-45
    3.2.7 系统发育分析  45-46
  3.3 讨论  46-47
  3.4 小结  47-49
4 日本七鳃鳗 Lj-CTSL 基因表达、蛋白纯化  49-61
  4.1 半定量 RT-PCR 法检测 Lj-CTSL 的表达  49-52
    4.1.1 材料  49
    4.1.2 方法  49-51
    4.1.3 结果  51-52
  4.2 日本七鳃鳗 Lj-CTSL 基因原核表达及重组蛋白纯化  52-59
    4.2.1 材料  52
    4.2.2 方法  52-57
    4.2.3 结果  57-59
  4.3 讨论  59-60
  4.4 小结  60-61
5 重组蛋白 rLj-CTSL 功能的初步探究  61-67
  5.1 材料  61
  5.2 方法  61-62
    5.2.1 细胞培养  61
    5.2.2 细胞增殖实验  61
    5.2.3 血管新生实验  61-62
  5.3 结果  62-65
    5.3.1 rLj-CTSL 对 MA、HUVEC 和 ECV304 细胞增殖的抑制作用  62-64
    5.3.2 rLj-CTSL 对 bFGF 诱导的鸡绒毛尿囊膜（CAM）血管新生的抑制作用  64-65
  5.4 讨论  65-66
  5.5 小结  66-67
6 结论  67-68
本论文的创新点  68-69
参考文献  69-73
附录 A 不同物种的 CTSL 的 FASTA 格式氨基酸序列  73-75
附录 B 表达载体 pTWIN1 质粒图谱  75-76
附录 C 蛋白质浓度测定标准曲线  76-77
研究生期间发表文章及研究成果  77-78
致谢  78

日本七鳃鳗组织蛋白酶L的克隆表达及功能分析

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