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日本七鳃鳗IRF基因克隆、表达抗体制备及相关免疫学研究

作　者: 郑珍
导　师: 李庆伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: IRF 日本七鳃鳗进化免疫应答
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

IRF因在病毒感染时能够结合到干扰素基因的启动子上，诱导调节干扰素的表达而得名。作为多功能转录因子，IRF在干扰素基因的转录调控、细胞因子信号转导、造血干细胞发育、肿瘤的抑制以及病毒感染后的免疫调节等方面发挥着重要作用，这使得IRF成为重要的免疫调节因子以及肿瘤治疗的潜在药物靶点。七鳃鳗在进化地位上处于无脊椎动物与脊椎动物之间。作为最古老的无颌类脊椎动物的代表，七鳃鳗拥有着独特的进化地位和适应性免疫系统。鉴于IRF在脊柱动物的免疫系统中所特有的防御机制，七鳃鳗的IRF具备怎样的免疫应答体系以及是否具有肿瘤抑制功能呢？目前有关七鳃鳗IRF的研究尚不清楚。而我们首次对于日本七鳃鳗IRF的初步探究，无论是在起源与进化上还是在IRF的新功能的研究上将具有非常重要的意义。本研究通过PCR的方法扩增得到长550bp的日本七鳃鳗IRF核苷酸序列。选取长372bp的IRF开放阅读框，重新克隆和构建IRF原核表达载体。用原核表达及亲和纯化得到的较纯的IRF重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔，制备兔抗日本七鳃鳗IRF多克隆抗体。用ELISA和Western blot方法检测纯化后的多克隆抗体的效价和特异性，得到效价为1:51万且具有良好特异性识别能力的兔抗日本七鳃鳗IRF多克隆抗体。进一步对IRF进行相关的免疫学研究。Western blot结果显示，IRF分子主要表达于日本七鳃鳗的心、鳃、肾和髓样组织中。同时，免疫组化结果也显示IRF主要表达于上述四个组织中。受到HMGB1刺激后的免疫组化结果显示，IRF除了分布在七鳃鳗的心、鳃、肾和髓样等组织外，在肠中也出现少量表达。说明HMGB1可能影响IRF的表达，IRF可能与HMGB1共同参与了致炎效应的Jak/Stat信号通路。利用免疫沉淀的方法找出可能与IRF相互作用的蛋白。以上数据为今后研究IRF分子在适应性免疫的起源与进化方面以及其新功能的研究提供了一定的参考。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-16
  1.1 IRF 的结构特征  9
  1.2 IRF 的作用机制  9-10
  1.3 IRF 在信号通路中的作用  10-12
    1.3.1 IRF 在 IFN 信号通路中的作用  10-11
    1.3.2 IRF 在 TLR 信号通路中的作用  11-12
  1.4 IRF 在造血干细胞发育中的作用  12-13
    1.4.1 IRF 在髓样细胞发育中的作用  12
    1.4.2 IRF 在 NK 细胞发育中的作用  12
    1.4.3 IRF 在巨噬细胞发育中的作用  12
    1.4.4 IRF 在 T、B 细胞发育中的作用  12-13
  1.5 IRF 在免疫调节中的作用  13
  1.6 IRF 在肿瘤中的作用  13-14
  1.7 IRF 在细胞凋亡中的作用  14
  1.8 结语及本文研究意义  14-16
第2章日本七鳃鳗 IRF 基因的分子克隆及生物信息学分析  16-30
  2.1 日本七鳃鳗 IRF 基因的分子克隆  16-22
    2.1.1 实验动物及材料  16
    2.1.2 方法  16-22
    2.1.3 结果  22
  2.2 日本七鳃鳗 IRF 蛋白氨基酸序列生物信息分析  22-28
    2.2.1 数据库和软件  22-23
    2.2.2 二级结构预测  23
    2.2.3 三级级结构模拟  23
    2.2.4 同源序列比对  23
    2.2.5 系统进化树构建  23
    2.2.6 结果  23-28
  2.3 讨论  28
  2.4 小结  28-30
第3章日本七鳃鳗 IRF 重组质粒的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备  30-47
  3.1 日本七鳃鳗 IRF 的原核表达及重组蛋白纯化  30-40
    3.1.1 材料  30-31
    3.1.2 方法  31-37
    3.1.3 结果  37-40
  3.2 兔抗日本七鳃鳗 IRF 多克隆抗体的制备及鉴定  40-46
    3.2.1 材料  40-41
    3.2.2 免疫方法及免疫程序  41
    3.2.3 ELISA 法检测抗体效价  41-42
    3.2.4 抗体纯化  42-43
    3.2.5 Western Blot 鉴定多克隆抗体的特异性  43
    3.2.6 结果  43-46
  3.3 讨论  46
  3.4 小结  46-47
第4章日本七鳃鳗 IRF 蛋白的 Western blot、免疫组化及免疫沉淀研究  47-55
  4.1 Western blot 分析 IRF 蛋白在各组织的表达情况  47-48
    4.1.1 材料  47
    4.1.2 方法  47
    4.1.3 结果  47-48
  4.2 免疫组织化学方法分析 IRF 在各组织中的分布情况  48-51
    4.2.1 材料  48
    4.2.2 方法  48-49
    4.2.3 结果  49-51
  4.3 免疫沉淀分析可能与 IRF 相互作用的蛋白  51-53
    4.3.1 材料  51-52
    4.3.2 方法  52
    4.3.3 结果  52-53
  4.4 讨论  53-54
  4.5 小结  54-55
结论  55-56
本论文创新点  56-57
参考文献  57-60
附录 A 克隆得到 IRF 基因的核苷酸序列和氨基酸序列  60-61
附录 B 同源比对中各物种 FASTA 格式的 IRF 氨基酸序列  61-64
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  64-65
致谢  65

日本七鳃鳗IRF基因克隆、表达抗体制备及相关免疫学研究

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