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大肠杆菌氮代谢调节蛋白GlnG对假单胞菌固氮岛表达的调控

作　者: 陈清华
导　师: 陆伟
学　校: 中国农业科学院
专　业: 微生物学
关键词: 生物固氮 重组大肠杆菌 固氮岛基因表达 氮代谢调控蛋白 NR_I（GlnG NtrC）
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本实验室已成功地将施氏假单胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）的固氮岛转入大肠杆菌DH10B（Escherichia coli DH10B）中，获得了具有固氮活性的重组大肠杆菌EN-01。然而EN-01的固氮活性仅为野生型A1501的十分之一。生物固氮是一个复杂的调控过程，涉及一系列信号转导和效应蛋白的参与。然而转入大肠杆菌的固氮岛内并不包含这些调控基因，因此需要重组大肠杆菌一般氮代谢调节网络中的相应蛋白负责参与其固氮过程的调控。在施氏假单胞菌中，一般氮代谢调节蛋白NtrC是在氮限制条件下激活固氮岛内基因表达的关键，同时也是激活许多参与氮吸收和代谢的基因表达所必需的。而在重组大肠杆菌EN-01中，一般氮代谢调节蛋白GlnG是其氮限制条件下选择性氮源同化途径中的全局激活子，因此它能否像NtrC一样有效地参与调节异源固氮岛内相关基因的表达以及其调控效率如何，对重组大肠杆菌EN-01的固氮活性将有重要影响。因此本论文主要围绕大肠杆菌GlnG蛋白对外源固氮岛内基因表达的调控功能进行相关研究。主要结果如下：1.本研究通过生物信息学分析发现DH10B GlnG和A1501NtrC具有相似的结构。其中DH10BGlnG与A1501NtrC的氨基酸序列一致性约为65.35%。两个蛋白质的二级结构组成及高级结构也非常相似，并且两蛋白质的分子量、等电点等理化性质非常接近。2.本研究证实了DH10B GlnG和A1501NtrC在一般氮代谢和固氮过程中的功能互补性。利用DH10B GlnG互补A1501NtrC突变株得到的功能互补株不仅能够在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养基上生长，而且具有一定的固氮活性，约为野生型A1501固氮活性的45%，同时利用A1501NtrC互补DH10B GlnG突变株得到的功能互补株能够在以精氨酸为唯一氮源的培养基上生长。由此可知在重组大肠杆菌中GlnG能够参与固氮基因的表达调控，但是与A1501NtrC相比固氮调控能力偏低，这可能是导致重组大肠杆菌固氮活性较低的原因之一。3.本研究证实了磷酸化GlnG蛋白能够体外结合异源固氮岛内的正调节基因nifA的启动子区。因为GlnG蛋白仅在磷酸化的状态才能激活受其调控基因的转录，所以获得磷酸化的GlnG蛋白（GlnG-P）是研究该蛋白与目的基因相互作用的前提条件。本研究采用融合PCR的方法将大肠杆菌DH10B GlnG氨基酸序列的第54位氨基酸从天冬氨酸替换为谷氨酸，第160位氨基酸从丝氨酸替换为苯丙氨酸，实现了不需要被NR_II磷酸化就能够激活转录的GlnG-P蛋白的组成型表达，然后体外分离纯化得到了GlnG-P蛋白。接下来通过凝胶阻滞实验证实了重组大肠杆菌GlnG-P蛋白能够与A1501固氮岛内nifA基因的启动子区发生结合即互作。由此可知在重组大肠杆菌中磷酸化的GlnG蛋白能够直接与nifA基因启动子区结合来调控固氮岛内其他相关基因的表达。上述研究结果为进一步明确大肠杆菌GlnG蛋白对外源固氮岛表达的调控功能及研究重组菌生物固氮的调控网络，优化重组菌的固氮活性奠定了基础。

全文目录


附件  4-6
摘要  6-7
Abstract  7-15
英文缩略表  15-16
第一章 文献综述  16-31
  1.1 前言  16
  1.2 固氮的遗传基础——固氮基因簇  16-17
  1.3 共有固氮基因的鉴定  17-18
  1.4 不同固氮菌中固氮基因簇结构与进化分析  18-23
    1.4.1 变形菌门（Proteobacteria）微生物中的固氮基因簇  18-19
    1.4.2 蓝细菌门（Cyanobacteria）微生物中的固氮基因簇  19-20
    1.4.3 放线菌门（Actinobacteria）微生物中的固氮基因簇  20-21
    1.4.4 厚壁菌门（Firmicutes）微生物中的固氮基因簇  21-22
    1.4.5 绿弯菌门（Chloroflexi）微生物中的固氮基因簇  22
    1.4.6 绿菌门（Chlorobi）微生物中的固氮基因簇  22-23
    1.4.7 广古菌门（Euryarchaeota）微生物中的固氮基因簇  23
  1.5 固氮基因水平转移  23-25
  1.6 氮代谢调节  25-29
    1.6.1 肠杆菌中一般氮代谢调节  26
    1.6.2 生物固氮的调控  26-29
  1.7 立题依据和技术路线  29-31
    1.7.1 立题依据及本研究的目的意义  29-30
    1.7.2 技术路线  30-31
第二章 DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 结构的生物信息学分析  31-38
  2.1 材料与方法  31
    2.1.1 数据库  31
    2.1.2 应用软件  31
  2.2 结果与讨论  31-36
    2.2.1 DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 进化分析  31-32
    2.2.2 DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 结构比较  32-35
    2.2.3 DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 结构域分析  35
    2.2.4 肠杆菌 GlnG 与假单胞菌 NtrC 结合的 DNA 序列分析  35-36
  2.3 讨论  36-38
第三章 DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 在一般氮代谢过程中的功能互补研究  38-67
  3.1 材料与方法  38-54
    3.1.1 菌株、质粒来源  38
    3.1.2 培养基及溶液  38-40
    3.1.3 抗生素、酶类及生化试剂  40
    3.1.4 试剂盒  40-41
    3.1.5 仪器设备  41
    3.1.6 基因组及质粒 DNA 的提取  41-44
    3.1.7 PCR 反应及产物纯化  44-46
    3.1.8 目的片段连接 T 载体  46
    3.1.9 目的片段的酶切及纯化  46-48
    3.1.10 DNA 片段与目的载体的连接  48
    3.1.11 大肠杆菌的热击转化  48-49
    3.1.12 三亲结合实验  49-50
    3.1.13 以硝酸钾或尿素为唯一氮源条件下的生长曲线测定  50
    3.1.14 施氏假单胞菌固氮酶活测定  50-51
    3.1.15 大肠杆菌 GlnG 突变株的构建  51-52
    3.1.16 大肠杆菌的电击转化  52-53
    3.1.17 以精氨酸为唯一氮源条件下的生长曲线测定  53-54
  3.2 结果  54-64
    3.2.1 DH10B GlnG 互补 A1501 △NtrC 功能互补株的构建  54-59
    3.2.2 DH10B GlnG 互补 A1501 △NtrC 功能互补株的表型测定  59-61
    3.2.3 A1501 NtrC 互补 DH10B △GlnG 功能互补株的构建  61-63
    3.2.4 A1501 NtrC 回补 DH10B △GlnG 的功能互补株的表型测定  63-64
  3.4 讨论  64-67
第四章 DH10B GlnG 与 A1501 nifA 基因启动子区互作研究  67-102
  4.1 材料与方法  67-83
    4.1.1 菌株、质粒来源  67
    4.1.2 培养基及溶液  67-69
    4.1.3 抗生素、酶类及生化试剂  69-70
    4.1.4 试剂盒  70
    4.1.5 仪器设备  70
    4.1.6 试剂盒法提取质粒 DNA  70-71
    4.1.7 PCR 反应及产物纯化  71-74
    4.1.8 目的片段连接 T 载体  74
    4.1.9 目的片段的酶切及纯化  74-75
    4.1.10 DNA 片段与目的载体的连接  75
    4.1.11 大肠杆菌的热击转化  75-76
    4.1.12 GlnG-P 蛋白的表达与纯化  76-79
    4.1.13 聚丙烯酰胺凝胶电泳  79-80
    4.1.14 凝胶阻滞实验  80-82
    4.1.15 高效液相色谱法鉴定 EN-01 固氮条件下产生的有机酸  82-83
  4.2 结果  83-99
    4.2.1 通过融合 PCR 的方式实现 DH10B glnG 基因片段的定点突变  83-87
    4.2.2 磷酸化 DH10B GlnG（GlnG-P）克隆载体的构建  87-89
    4.2.3 磷酸化 DH10B GlnG（GlnG-P）表达载体的构建  89-92
    4.2.4 共表达蛋白 GlnG-P-Mxe-CBD 的诱导表达  92-95
    4.2.5 共表达蛋白 GlnG-P-Mxe-CBD 的纯化  95-96
    4.2.6 A1501 nifA 基因启动子区可能的 GlnG 结合位点分析  96-97
    4.2.7 凝胶阻滞实验探针的制备  97
    4.2.8 凝胶阻滞实验分析磷酸化 GlnG 蛋白与 nifA 基因启动子区的结合  97-98
    4.2.9 重组大肠杆菌 EN-01 固氮过程中产有机酸分析  98-99
  4.3 讨论  99-102
    4.3.1 凝胶阻滞实验分析磷酸化 GlnG 蛋白与目的基因启动子区的结合  99-100
    4.3.2 EN-01 固氮过程中产有机酸与能量代谢之间的关系分析  100-102
第五章 全文结论  102-103
参考文献  103-110
致谢  110-111
作者简历  111

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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