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重组类人胶原蛋白表达体系过程优化

作　者: 张兮
导　师: 范代娣
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: 重组大肠杆菌分批-补料培养动力学模型过程优化
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本文对重组大肠杆菌分批-补料培养生产类人胶原蛋白的发酵条件即诱导时机和诱导强度、富氧方式（葡萄糖反馈调控、适当提高罐压、通入富氧空气）、诱导前后比生长速率、补氮方式（连续补氮、阶段式补氮）、动力学模型进行了系统的研究,结果表明: 1.最佳诱导条件为对数生长中后期进行诱导,42℃保温2～3 h,然后降温至39℃继续培养5～6h,发酵结束时细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度可分别达68.94g/L（DCW）和13.16g/L。 2.诱导前的比生长速率影响细胞生长和类人胶原蛋白的表达,为获得尽可能多的细胞和目标蛋白,诱导前的最适比生长速率为0.15～0.20 h^-1;诱导后的比生长速率对表达期的细胞生长和类人胶原蛋白的表达产生显著影响,在此期间比生长速率过高或过低均不利于目标蛋白的合成,且最适比生长速率为0.04～0.05h^-1,发酵结束时细胞和类人胶原蛋白的浓度可分别达69.5g/L（DCW）和13.8g/L。 3.最佳的发酵条件为:采用阶段式补氮方式;当溶氧低于20%（空气饱和度）,适当提高罐压（0.3～0.8^*10⁵ Pa）维持溶氧在20%;最终细胞浓度为76.01g/L（DCW）,类人胶原蛋白浓度为16.75 g/L。 4.利用MATLAB最小二乘法（lsqnonlin）和四五阶Runge-kutta（ode45）对动力学模型的参数进行优化求解,结果表明动力学模型与实验值吻合良好。在分批发酵阶段,动力学模型为 μ=（0.727s）/（0.674+s）, （ds）/（dt）=-（（0.727sx）/（0.352（0.674+s）））-0.054x; 在补料阶段（诱导前）的动力学模型为 μ=（0.727s）/（0.674+s）, （dx）/（dt）=（（0.727sx）/（0.674+s））-（1/（s_f-s））[（（0.727sx）/（0.179（0.674+s）））+0.054x],

全文目录

第一章综述  10-27
  1.1 胶原蛋白概述  10-14
    1.1.1 胶原蛋白的存在  10-12
    1.1.2 胶原蛋白的氨基酸组成  12
    1.1.3 胶原蛋白的结构  12-13
    1.1.4 胶原蛋白的性能及应用  13-14
  1.2 重组胶原蛋白  14-17
    1.2.1 重组胶原蛋白概述  14-15
    1.2.2 重组胶原蛋白的表达系统  15-16
    1.2.3 国内外研究现状  16
    1.2.4 类人胶原蛋白的优越性  16
    1.2.5 类人胶原蛋白的应用领域  16-17
  1.3 高密度发酵及过程优化  17-26
    1.3.1 高密度发酵  17-24
    1.3.2 微生物反应动力学  24-26
  1.4 本研究的目的、意义及内容  26-27
    1.4.1 目的与意义  26
    1.4.2 实验内容及拟解决的问题  26-27
第二章材料与方法  27-35
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 供试菌种  27
    2.1.2 主要仪器  27-28
    2.1.3 主要试剂  28
    2.1.4 培养基  28-29
  2.2 实验方法  29
    2.2.1 培养发酵方法  29
  2.3 分析测定方法  29-35
    2.3.1 菌体浓度测定  30
    2.3.2 细胞干重测定  30
    2.3.3 残糖测定  30
    2.3.4 NH_2-R测定  30-31
    2.3.5 菌体活性与质粒稳定性测定  31
    2.3.6 温度、转速、溶解氧浓度(DO)、pH、补料速度测定  31
    2.3.7 总蛋白浓度测定  31-32
    2.3.8 胶原蛋白含量测定  32-35
第三章重组大肠杆菌分批-补料发酵生产类人胶原蛋白诱导条件优化  35-38
  3.1 材料与方法  35
    3.1.1 发酵方法  35
  3.2 结果与分析  35-37
    3.2.1 诱导时机的选择  35-36
    3.2.2 诱导强度的选择  36-37
  3.3 结论  37-38
第四章重组大肠杆菌分批-补料发酵生产类人胶原蛋白控氧方式优化  38-45
  4.1 材料与方法  38-39
    4.1.1 发酵方法  38
    4.1.2 控氧方法  38-39
  4.2 结果与分析  39-43
    4.2.1 不同控氧方式对细胞生长的影响  39-42
    4.2.2 不同控氧方式对目标蛋白表达的影响  42-43
  4.3 结论  43-45
第五章重组大肠杆菌分批-补料发酵的比生长速率优化  45-55
  5.1 材料与方法  45
    5.1.1 发酵方法  45
  5.2 结果与分析  45-53
    5.2.1 诱导前最佳比生长速率的确定  45-50
    5.2.2 诱导后最佳比生长速率的确定  50-53
  5.3 结论  53-55
第六章重组大肠杆菌分批-补料发酵生产类人胶原蛋白补氮策略优化  55-61
  6.1 材料与方法  55
    6.1.1 发酵方法  55
  6.2 结果与分析  55-60
    6.2.1 连续流加补氮方式的高密度培养  55-56
    6.2.2 阶段式补氮方式的高密度培养  56-57
    6.2.3 不同补氮方式下溶氧对类人胶原蛋白表达的影响  57-58
    6.2.4 不同补氮方式下比生长速率对细胞生长和类人胶原蛋白表达的影响  58-59
    6.2.5 不同补氮方式对Y_(X/S)和Y_(P/S)的影响  59-60
  6.3 结论  60-61
第七章重组大肠杆菌分批-补料培养的动力学  61-68
  7.1 材料与方法  62
    7.1.1 发酵方法  62
  7.2 结果与分析  62-67
    7.2.1 分批发酵阶段动力学分析  62-63
    7.2.2 补料后诱导前的动力学分析  63-65
    7.2.3 类人胶原蛋白生产期的动力学分析  65-67
  7.3 结论  67-68
参考文献  68-73
致谢  73

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