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SNX16和SNX11的结构生物学研究

作　者: 徐进新
导　师: 刘劲松
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 结构生物学
关键词: SNX16 Coiled coil结构域 PX结构域 PI3P结合口袋 SNX11 PXe结构域 晶体结构
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


Sorting nexins(SNXs)是一类含有SNX-PX结构域,并在膜泡运输中发挥重要作用的蛋白。PX结构域能与磷脂酰肌醇结合,并介导含有PX结构域的蛋白与富含特定磷脂酰肌醇的膜结合。目前在哺乳动物中已经发现了33种SNXs,有些SNXs只含有PX结构域；有些除了含有PX结构域还含有其他结构域。根据结构域的组成,SNXs可以分为：SNXPX、SNXPX-BAR和SNXPX-other。Sorting nexin16(SNX16)属于SNXPX-other,它除了含有PX结构域外,在C端还有一个Coiled coil结构域。有研究表明,SNX16既能结合初级内体也能结合次级内体,并在表面生长因子受体(EGFR)由初级内体向次级内体的运输中发挥着重要的作用。在果蝇的神经细胞中,SNX16参与突触生长受体(synaptic growth receptor)的运输和突触生长信号传递的调节。研究还表明,SNX16与水泡口炎病毒感染、膀胱癌和丙肝病毒的复制有关,SNX16可能是治疗这些疾病的潜在靶标。目前SNX16发挥功能的分子机制还不清楚,为了更好的了解SNX16执行功能的结构基础,我们开展了SNX16的结构生物学研究。我们解析了SNX16的一个片段(SNX16100-278,氨基酸从100刘278)的3.3A(空间群P21)和3.35A(空间群P212121)的晶体结构。SNX16100-278形成稳定的、剪刀状的二聚体。SNX16100-278包含PX结构域和Coiled coil结构域。二聚体中,两条链的Coiled coil结构域形成平行的左手超螺旋结构。通过结构分析和分子对接,我们发现SNX16100-278二聚体中PX结构域和Coiled coil结构域共同组成独特的PI3P结合口袋。通过将SNX16-PX和高同源性的nCISK-PX结构域进行比对分析,我们发现PX结构域中PPII/a2的构象可调节传统的磷脂酰肌醇结合口袋的大小,并进而决定PX结构域与磷脂酰肌醇结合的特异性。SNXPX是一类仅含有PX结构域的SNXs蛋白。目前认为SNX3、SNX10、 SNX11、SNX12、SNX22和SNX24都属于SNXPX。结构研究也表明,Grd19p(酵母SNX3)、SNX12和SNX22除了具有传统的PX结构域外,不含有其他的结构域。最近一些SNXPX蛋白的生物学功能也开始被研究。SNX3参与组成retromer复合物,调节Wntless的循环运输。SNX10具有诱导细胞成泡的功能。但是这些蛋白发挥功能的结构基础还不知道。进一步的研究发现,SNX10中单独的传统PX结构域并不具备诱导细胞成泡的功能,传统PX结构域下游的31个氨基酸也是SNX10发挥功能所必须的。为了探明SNX10传统PX结构域下游的31个氨基酸是否具有结构,以及SNX10传统PX结构域和下游的31个氨基酸在结构上是如何组织的。我们对SNX10和SNX10的同源蛋白-SNX11(SNX10和SNX11的氨基酸序列有52%的一致性)进行了结构生物学研究。我们没有获得SNX10的晶体,但我们获得了SNX11两个片段(SNX11-142C和SNX11-170C)的晶体结构。通过分析SNX11-170C的结构,我们发现在SNX11传统PX结构域的下游有2个α螺旋(α4和α5),这两个螺旋与上游传统PX结构域形成紧密的球状结构。据此,我们推测SNX11-170C可能代表了一个新的PX结构域,我们称之为PX-extended(PXe)结构域。通过序列分析,我们推测SNX10可能也具有这个新的PXe结构域。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章 SNXs家族蛋白概述  14-28
  1.1 Sorting nexins(SNXs)  14-15
  1.2 PX结构域  15-18
    1.2.1 PX结构域的结构  15-16
    1.2.2 PX结构域介导PX蛋白与膜结合  16-18
    1.2.3 PX结构域与蛋白相互作用  18
  1.3 SNXs与蛋白分选运输  18-24
    1.3.1 SNXs与网格蛋白介导的细胞内吞  19-20
    1.3.2 SNXs参与调节蛋白由初级内体到溶酶体的运输  20-21
    1.3.3 SNXs调节营养素受体由初级内体向质膜的循环运输  21-22
    1.3.4 SNXs调节蛋白由内体向反面高尔基体网的运输  22-24
  1.4 SNXs蛋白与信号传递  24-26
  1.5 SNXs蛋白的结构生物学研究现状、意义  26-28
第一部分 SNX16的结构生物学研究  28-78
  第二章 SNX16的研究背景  28-34
    2.1 SNX16的结构域组成  28
    2.2 Coiled coil结构域  28-31
      2.2.1 Coiled coil结构域概述  28
      2.2.2 Coiled coil结构结构域的结构特征  28-31
    2.3 SNX16的结构与功能  31-34
      2.3.1 Coiled coil结构域参与SNX16的寡聚化  31-32
      2.3.2 SNX16与内体运输  32
      2.3.3 SNX16与疾病  32-34
  第三章 实验材料、设备与方法  34-43
    3.1 实验材料  34-35
      3.1.1 质粒与菌株  34
      3.1.2 试剂  34-35
      3.1.3 仪器设备  35
    3.2 实验方法  35-43
      3.2.1 重组质粒的构建  35-37
      3.2.2 目的蛋白的表达  37-39
      3.2.3 目的蛋白的纯化  39-40
      3.2.4 蛋白酶解实验  40
      3.2.5 蛋白甲基化修饰  40-41
      3.2.6 动态光散射(DLS)实验  41
      3.2.7 Native-PAGE实验  41
      3.2.8 蛋白质结晶  41-42
      3.2.9 数据收集和结构解析  42-43
  第四章 结果与讨论  43-77
    4.1 全长SNX16的纯化  43-45
    4.2 SNX161~(101-283)的纯化和结晶  45-49
      4.2.1 野生型和硒代SNX16~(101-283)的纯化和结晶  45-48
      4.2.2 SNX16~(101-283)的甲基化以及甲基化SNX16~(101-283)的结晶和优化  48-49
    4.3 SNX16~(100-278)的纯化和结晶  49-53
      4.3.1 野生型SNX16~(100-278)的纯化  49-50
      4.3.2 SNX16~(100-278)的甲基化  50-52
      4.3.3 野生型、甲基化和甲基化硒代SNX161~(100-278)的晶体筛选和优化  52-53
    4.4 甲基化硒代的SNX16~(100-278)晶体衍射数据收集、结构解析和结构修正  53-62
      4.4.1 数据收集与处理  53-54
      4.4.2 结构解析  54
      4.4.3 SNX16~(100-278)-P2_1和SNX16~(100-278)-P2_12_12_1的结构修正  54-56
      4.4.4 SNX16~(100-278)-P2_1和SNX16~(100-278)-P2_12_12_1结构模型的质量评估  56-62
    4.5 SNX16~(100-278)的结构分析  62-77
      4.5.1 SNX16~(100-278)的总体结构  62-63
      4.5.2 SNX16~(100-278)的Coiled coil结构域  63-65
      4.5.3 SNX16的PX结构域  65-68
      4.5.4 SNX16~(100-278)结构域之间的相互作用  68-71
      4.5.5 SNX16~(100-278)二聚体结构中独特的PI3P结合口袋  71-75
      4.5.6 SNX16~(100-278)二聚体结构中的膜结合界面  75-77
  本篇小结  77-78
第二部分 SNX11的结构生物学研究  78-101
  第五章 SNX11的研究背景  78-80
    5.1 前言  78
    5.2 SNX~(PX)调节内体的形态发生  78-79
    5.3 SNX~(PX)的结构与功能  79-80
  第六章 实验材料、设备与方法  80-86
    6.1 实验材料  80-81
      6.1.1 质粒与菌株  80
      6.1.2 试剂  80
      6.1.3 仪器设备  80-81
    6.2 实验方法  81-86
      6.2.1 重组质粒的构建  81-82
      6.2.2 目的蛋白的表达  82-83
      6.2.3 蛋白的纯化  83
      6.2.4 蛋白甲基化修饰  83-84
      6.2.5 蛋白质结晶  84
      6.2.6 数据收集、结构解析和修正  84-86
  第七章 结果与讨论  86-100
    7.1 晶体衍射数据处理、结构解析与修正  86-89
      7.1.1 晶体衍射数据处理  86
      7.1.2 结构解析与修正  86-88
      7.1.3 结构模型的质量评估  88-89
    7.2 SNX11-142C和甲基化的SNX11-170C的结构分析  89-100
      7.2.1 SNX11-142C和甲基化的SNX11-170C的总体结构  89-91
      7.2.2 SNX11-170C是一个新的PX结构域  91-92
      7.2.3 SNX11-PXe结构域的膜结合界面分析  92-96
      7.2.4 SNX11的多序列比对和功能域分析  96-97
      7.2.5 不同PX结构域β 2/β 3 Loop的分析  97-100
  本篇小结  100-101
第三部分 其他SNXs蛋白的研究  101-107
  第八章 SNX17的研究  101-106
    8.1 研究背景  101-104
      8.1.1 前言  101
      8.1.2 SNX17及其同源蛋白的结构特征  101-102
      8.1.3 SNX17参与质膜蛋白的运输  102-103
      8.1.4 SNX17及同源蛋白与信号传导  103
      8.1.5 PX-FERM-like蛋白与Ras及跨膜蛋白的结合模型  103-104
    8.2 实验结果与讨论  104-106
      8.2.1 人源SNX17的表达与纯化  104
      8.2.2 斑马鱼SNX17(dSNX17)的表达与纯化  104-106
  第九章 SNX7的研究  106-107
参考文献  107-118
附录1 载体图谱  118-120
附录2 分子克隆的一些方法  120-124
附录3 聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  124-127
附录4 培养基配制  127-129
致谢  129-130
在读期间发表的学术论文与参加的学术会议  130

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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