学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

AIF-1基因的原核表达及细胞分布的初步研究

作　者: 杨振
导　师: 曹祥荣
学　校: 南京师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 同种异体移植炎症因子 原核表达 细胞分布 系统发生
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 13次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


同种异体移植炎症因子(allograft inflammatory factor-1,AIF-1),又称离子化Ca2+结合调节器(ionized calcium-binding adapter molecule1, Ibal),最初克隆自大鼠发生慢性排斥反应的同种异体心脏移植物中。到目前为止,许多物种的AIF-1基因已被克隆,包括人、小鼠、鲤鱼、海绵、盘鲍等。AIF-1在大鼠精细胞中高表达,在多种组织及血清中有低蛋白水平存在。AIF-1能够结合并交联肌动蛋白,在巨噬细胞/小胶质细胞细胞骨架的重组中具有重要的作用。在动脉损伤和炎症下的血管平滑肌细胞中,AIF-1可被诱导产生,并能促进其增殖和迁移。此外,子宫内膜异位病人的腹水及类风湿性关节炎患者的关节滑液中,AIF-1的表达上调。AIF-1的表达分布机制及与病理过程的相关性,需要进一步深入研究。首先我们从毛冠鹿(Elaphodus cephalophus, tufted deer)睾丸cDNA文库中克隆到AIF-1基因。该cDNA具有5’和3’非编码区,从第81个到第518个核苷酸为一开放阅读框,编码一个145aa的AIF-1蛋白。根据cDNA序列设计引物,将基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。结果显示,重组质粒经1mmol/L IPTG诱导4h后,在约20kDa处有一明显条带与理论值大小相近,Western Blot检测其可被抗AIF-1抗体识别,说明表达成功。超声破碎后离心,重组蛋白主要存在于上清液中,可用于制备抗体以进行后续实验。其次我们检测了不同细胞系中AIF-1mRNA和蛋白质水平的表达状况。RT-PCR和Western Blot结果显示,AIF-1在HL-60细胞系中高表达,在Jurkat细胞系中表达水平较低。设计引物,从HL-60细胞系中克隆人AIF-1cDNA,构建真核表达载体pEGFP-C3-AIF-1, pEGFP-N1-AIF-1,通过EGFP示踪AIF-1蛋白的细胞分布。转染Hela、293、MCF-7细胞系后,固定染色,用荧光显微镜拍照。结果显示,与空载体相比,外源融合蛋白过表达,影响了AIF-1在核质上的分布。最后,序列比较分析确认毛冠鹿AIF-1是AIF-1家族的成员,具有很高的进化保守性,系统发生树显示毛冠鹿与牛、山羊具有较近的亲缘关系,同传统的分类方法一致。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
第一章 综述  8-16
  1.1 AIF-1的研究进展  8-13
    1.1.1 AIF-1与炎症  9-10
    1.1.2 AIF-1与器官移植  10-11
    1.1.3 AIF-1与血管病变  11-12
    1.1.4 AIF-1与中枢神经系统疾病  12
    1.1.5 AIF-1与生殖  12-13
    1.1.6 AIF-1与肿瘤  13
  1.2 毛冠鹿与进化研究  13-16
    1.2.1 毛冠鹿与麂亚科动物  13-14
    1.2.2 毛冠鹿与进化  14-16
第二章 毛冠鹿AIF-1基因克隆和原核表达  16-27
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 材料  16
    2.1.2 实验仪器  16-17
    2.1.3 主要试剂配制  17
  2.2 实验方法  17-20
    2.2.1 毛冠鹿AIF-1序列分析  17
    2.2.2 原核表达载体的构建  17-18
    2.2.3 重组质粒原核表达及条件优化  18-19
    2.2.4 重组蛋白的纯化  19-20
  2.3 实验结果  20-25
    2.3.1 毛冠鹿AIF-1序列分析  20-21
    2.3.2 原核表达载体的构建  21-23
    2.3.3 重组蛋白表达、条件优化及纯化  23-25
  2.4 讨论  25-27
第三章 不同细胞系中AIF-1表达差异分析及细胞分布  27-38
  3.1 实验材料  27-29
    3.1.1 材料  27
    3.1.2 主要实验仪器  27-28
    3.1.3 主要试剂配制  28
    3.1.4 所用引物  28-29
  3.2 实验方法  29-32
    3.2.1 RT-PCR检测  29-30
    3.2.2 真核表达载体的构建  30-31
    3.2.3 Western Blot分析  31
    3.2.4 重组质粒转染细胞及制作爬片  31-32
  3.3 实验结果  32-36
    3.3.1 AIF-1 mRNA和蛋白质水平检测  32-33
    3.3.2 AIF-1重组质粒构建  33-34
    3.3.3 EGFP标签质粒转染荧光分布  34-36
  3.4 讨论  36-38
第四章 毛冠鹿AIF-1的进化分析  38-43
  4.1 实验方法  38
    4.1.1 AIF-1蛋白序列比对与分析  38
  4.2 实验结果  38-41
    4.2.1 AIF-1蛋白的一致性比较  38-39
    4.2.2 AIF-1蛋白的序列比对  39-41
    4.2.3 AIF-1蛋白进化分析  41
  4.3 讨论  41-43
参考文献  43-48
致谢  48

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  4. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  5. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  6. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  7. 兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究,S855.12
  8. 兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立,S858.291
  9. 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代苗期耐盐性与NHX1基因功能的初步研究,S565.1
  10. 鲤鱼肠道sglt1的表达与抗体制备,S917.4
  11. 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin4的基因克隆、表达及多克隆抗体制备,S881.26
  12. 红细胞分布宽度对急性冠脉综合征患者预后关系的临床研究,R541.4
  13. 慢性心力衰竭红细胞分布宽度变化及其对预后的影响,R541.6
  14. 耐辐射菌PprI蛋白的制备及其对小鼠急性辐射损伤作用的研究,R818
  15. 半夏蛋白的分离纯化及结构分析,S567.239
  16. 小麦郑9023新型储藏蛋白基因avenin-like b的克隆和原核表达分析,S512.1
  17. 东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析,Q953
  18. 新疆荷斯坦牛β防御素5克隆表达及抑菌活性分析,S858.23
  19. 刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因的生物信息学分析、克隆表达及免疫保护性研究,R38
  20. 猪链球菌2型强毒株05ZYH33二元信号转导系统CiaRH生物学功能研究,S852.611
  21. 圆舌浮蛙（Occidozyga martensii）线粒体基因组结构及新蛙亚目的系统发生关系研究,Q78

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com