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尿液分离细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立

作　者: 薛燕婷
导　师: 裴端卿
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 非整合人诱导多能干细胞 iPS细胞尿液细胞附加体微核糖核酸miR-302-367簇细胞库
分类号: R329.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

人的体细胞可以经几个转录因子转变为诱导多能干细胞(iPS细胞)。这些细胞可以在体外自我更新、分化成三个胚层的细胞,避免了免疫排斥和伦理争议等问题,在药物筛选、疾病模型以及再生医学等方面具有巨大的应用潜力,获得了人们的广泛关注。目前,人iPS细胞可以从不同类型的体细胞,如皮肤细胞,血液细胞等诱导而来。何种类型的细胞更易获取,且诱导效率较高并不明确。而且,大多数iPS细胞的研究采用了病毒方法,由此引起的安全性问题限制了iPS细胞进一步的应用。为加速人诱导多能干细胞的研究,优化出一套无饲养层细胞、无病毒插入、无动物血清的诱导流程非常关键。在基础上建立一个具有广泛遗传背景的非整合的人iPS细胞库将是一个重要的疾病模型和机理研究的资源。我们的匿名调查结果显示尿液是最被捐赠者接受的成体细胞捐赠材料。我们优化的收集方法可以成功地从不同年龄、性别及疾病患者尿液中分离出尿液细胞。我们已收集到患有神经系统、血液系统等疾病或者正常人的近50株尿液细胞,这些细胞捐赠者年龄从2岁到70岁不等。利用这些尿液细胞,我们优化了非整合诱导的重编程流程。这一流程采用附加体将重编程因子导入尿液细胞中,整个过程不使用饲养层细胞、不使用病毒载体、并采用成分完全确定的人多能干细胞培养基培养。我们验证最后得到的人iPS细胞无外源基因整合且具有多能性。与此前报道的附加体重编程方法相比,由于尿液细胞具有上皮细胞特性更易重编程,诱导时间缩短为20天,效率最高达到0.015%。另外,可以使用更少的重编程因子进行诱导,通过采用miR-302-367簇代替癌基因c-MYC,从而获得更加安全的人诱导多能干细胞。我们优化的尿液细胞重编程方法具有广泛的适应性,可用于重编程此前收集到的不同年龄、性别及疾病患者的尿液细胞。运用这一方法,我们已经将20个不同个体来源的尿液细胞重编程得到了97株人iPS细胞系。这些非整合的人iPS细胞经过一系列的鉴定后将给予冻存,组成尿液细胞来源的人iPS细胞库。我们将继续从尿液细胞的收集和培养,尿液细胞的诱导因子导入方法以及人iPS细胞的培养等方面优化整个重编程流程,使得整个过程满足cGMP的要求,从而为人iPS细胞在基础研究和再生医学方面的实际应用奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第1章绪论(干细胞领域的趋势和进展)  12-27
  1.1 干细胞概述和干细胞研究的趋势与进展  12-22
    1.1.1 Tfe3的核质穿梭决定了干细胞的幼稚态  14-15
    1.1.2 从混沌到有序——单细胞技术解析重编程分子机制  15-16
    1.1.3 DNA去甲基化酶Tet1在重编程中替代Oct4,调节成体神经发生和学习记忆  16-17
    1.1.4 H3K9甲基化是体细胞重编程的重要障碍  17
    1.1.5 体细胞重编程EMT-MET顺序化机理  17-18
    1.1.6 重编程的“跷跷板模型”——新型体细胞重编程因子  18
    1.1.7 化合物诱导小鼠iPS  18
    1.1.8 人iPS细胞向肝芽组织的分化、肝脏干细胞的体外分离及转分化获取肝脏干细胞  18-19
    1.1.9 人多能干细胞体外自发形成眼球光学视杯/神经视网膜及转分化获得神经干细胞  19-20
    1.1.10 重大突破——人类治疗性克隆胚胎干细胞建系成功  20-21
    1.1.12 小鼠孤雄单倍体干细胞的建立  21
    1.1.13 lincRNA调控胚胎干细胞自我更新  21-22
  1.2 非整合诱导人类iPS细胞的技术体系  22-27
    1.2.1 多种类型体细胞可用于诱导iPS细胞  22-23
    1.2.2 各种病毒诱导技术及非整合诱导技术的比较  23-25
    1.2.3 本论文研究的课题——建立非整合诱导技术体系下的iPS细胞库  25-27
第2章实验方法与实验材料  27-56
  2.1 尿液细胞的收集、培养与增殖检测  27-29
    2.1.1 实验试剂及实验材料  27
    2.1.2 尿液细胞的收集方法  27-28
    2.1.3 收集尿液细胞时的注意事项  28
    2.1.4 尿液细胞的培养及传代  28
    2.1.5 Edu检测尿液细胞增殖情况  28-29
  2.2 低内毒素质粒的大量制备  29-30
  2.3 使用LONZA电转仪及试剂盒电转尿液细胞或人皮肤成纤维细胞  30-31
    2.3.1 实验仪器及实验材料  30
    2.3.2 人尿液细胞的电转  30-31
    2.3.3 人皮肤成纤维细胞的电转  31
  2.4 pCEP4-hsa-miR-302-367 cluster质粒的构建与在真核细胞中的过表达检测  31-35
    2.4.1 实验仪器及实验材料  31
    2.4.2 pCEP4-hsa-miR-302-367 cluster质粒的构建  31-33
    2.4.3 pCEP4-hsa-miR-302-367 cluster质粒的过表达  33
    2.4.4 miR-302-367 cluster表达的定量检测  33-35
  2.5 人诱导多能干细胞系的建立  35-40
    2.5.1 实验仪器及实验材料  35-36
    2.5.2 人诱导多能干细胞克隆的挑取  36
    2.5.3 人诱导多能干细胞的扩增和培养  36-38
    2.5.4 人诱导多能干细胞分化的处理方法  38-39
    2.5.5 人诱导多能干细胞的冻存  39-40
    2.5.6 人诱导多能干细胞的复苏  40
  2.6 人诱导多能干细胞的鉴定  40-49
    2.6.1 碱性磷酸酶染色  40-41
    2.6.2 核型鉴定  41
    2.6.3 免疫荧光(Immunofluorescence)  41-42
    2.6.4 流式细胞法  42-43
    2.6.5 实时定量PCR检测(real-time qPCR)  43-45
    2.6.6 启动子甲基化检测  45-48
    2.6.7 拟胚体(Embryonic body,EB)形成实验  48
    2.6.8 畸胎瘤生成检测  48-49
  2.7 BIO-RAD电转仪电转方法  49
  2.8 使用的培养基配方及配制方法  49-53
  2.9 所使用主要试剂信息列表  53-54
  2.10 本文中所使用引物列表  54-56
第3章人尿液分离细胞库  56-65
  3.1 尿液细胞是用于建立人诱导多能干细胞库的良好供体细胞  56-57
  3.2 细胞可以从健康人和多种疾病患者以及不同年龄捐赠者的尿液中分离得到  57-60
  3.3 部分遗传疾病患者尿液细胞的检测  60-63
    3.3.1 肌萎缩性侧索硬化相关基因的检测  60
    3.3.2 Alport综合征相关基因的检测  60
    3.3.3 β地中海贫血相关基因的检测  60-63
  3.4 尿液细胞的增殖情况测定  63-65
第4章尿液细胞来源的非整合无饲养层人诱导多能干细胞重编程方法的建立  65-74
  4.1 Episome可以通过电转的方式以较高效率被导入尿液细胞  65-66
  4.2 尿液细胞可以在成分确定的人多能干细胞培养基中存活  66-67
  4.3 尿液细胞可以在无饲养层细胞及成分确定人多能干细胞培养基的条件下,通过episome诱导得到人iPS细胞  67-72
    4.3.1 尿液细胞可通过电转pEP4E02SET2K+pCEP4-M2L得到人诱导多能干细胞  68-69
    4.3.2 单独电转pEP4E02SET2K并不能使尿液细胞重编程  69
    4.3.3 组合中的LIN28和c-MYC可被microRNA-302-367 cluster代替得到更为安全的人诱导多能干细胞  69-71
    4.3.4 人皮肤成纤维细胞电转pEP4E02SET2K+pCEP4-has-miR-302-367 cluster无法得到人诱导多能干细胞  71-72
  4.4 尿液细胞比起人皮肤成纤维细胞在诱导iPS细胞方面更有优势  72-74
第5章尿液细胞来源非整合人多能干细胞库的建立与鉴定  74-85
  5.1 人诱导多能干细胞系的获得  74-75
  5.2 人诱导多能干细胞的鉴定  75-82
    5.2.1 碱性磷酸酶染色  75
    5.2.2 插入鉴定  75-76
    5.2.3 核型鉴定  76-77
    5.2.4 多能性相关基因表达量的检测  77-78
    5.2.5 免疫荧光染色  78
    5.2.6 流式细胞检测  78-79
    5.2.7 启动子甲基化检测  79-80
    5.2.8 拟胚体体外分化  80-81
    5.2.9 畸胎瘤形成  81-82
  5.3 尿液细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立  82-85
第6章诱导体系的优化与问题讨论  85-92
  6.1 诱导体系的进一步优化  85-90
    6.1.1 尿液细胞收集培养的优化  85-86
    6.1.2 电转条件的优化  86-89
    6.1.3 培养基质的优化  89-90
  6.2 讨论  90-92
    6.2.1 建立人诱导多能干细胞库的意义  90
    6.2.2 尿液细胞诱导的非整合多能干细胞与尿液细胞转分化的非整合神经干细胞  90-91
    6.2.3 小分子诱导人多能干细胞的讨论  91-92
参考文献  92-105
附录1 文章中所使用到的缩写词  105
附录2 伦理申明  105-106
致谢  106-108
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  108

尿液分离细胞来源非整合人诱导多能干细胞库的建立

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