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新型Ad/AAV嵌合病毒携带全长抗体基因对肿瘤治疗作用的研究

作　者: 徐凤青
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Ad/AAV嵌合病毒全长抗体基因治疗
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

实验证明肿瘤的基因靶向治疗可以提高治疗效果。研究人员利用基因治疗的方法,用病毒做为载体将全长抗体基因导入细胞,随着基因的表达,细胞自身产生的抗体就可以杀死肿瘤细胞。在2004年,我们实验室最早构建了携带全长抗体基因的腺病毒,实验证明其对肿瘤有良好的杀伤效果。但由于腺病毒本身的缺点导致抗体基因的表达不长效,进而限制了其临床应用。所以在基因治疗过程中,载体是基因治疗的关键。目前用于基因治疗的病毒载体有:腺相关病毒载体(AAV)、腺病毒载体、逆转录病毒载体以及慢病毒载体等,但各种载体都不尽如人意。腺相关病毒载体(AAV)基因组两端的两个倒转末端重复序列(ITR)具有可以完成病毒自身复制、包装的能力,并且可以形成AAV环形中间体,这些中间体ITR之间为两个开放阅读框,里面可以插入目的基因。根据这一的特点,我们在腺病毒载体里重组加入两个AAV的ITR,然后在ITR之间插入全长抗体基因序列,病毒感染靶细胞后,抗体基因可以在宿主染色体外形成环形中间体独立表达。这种新型嵌合病毒载体集中了腺病毒容量大、起效快的优点,又具有AAV可以长效表达的优点,是一种新型的理想病毒载体。本文先是通过Overlap-PCR的方法构建了AAV上游ITR(uITR)和下游ITR (dITR)融合基因片段,再将该融合基因重组进入5型腺病毒中构成新型嵌合病毒载体,然后在新型病毒的ITR中插入抗体Cetuximab(AT2)基因片段构成携带全长抗体的新型嵌合病毒A/V659-AT2。以实验室已有携带同样抗体基因的重组腺病毒载体AD359-AT2为对照组,检测新型病毒在嵌合了AAV ITR后对抗体基因表达的影响。收集两种病毒感染细胞2、4、6、8天后的细胞上清,通过ELISA和Western blot的方法检测Cetuximab(AT2)抗体的表达情况。ELISA结果发现,这两种病毒在体外都能够顺利表达AT2抗体蛋白,和商品化的Cetuximab大小分子量相同。并且抗体的表达量在前4天的相差不大,但在第6天对照组的抗体表达量开始下降,到第8天时表达量由最高时的138.82ng/ml降为58.49 ng/ml;Western Blot显示其在第6天时轻链重链开始不匹配,在第8天时轻链条带不明显。但携带AAV ITR的新型Ad/AAV嵌合病毒的抗体表达量比较恒定,一直在110ng/ml左右,Western Blot显示其轻重链表达量相匹配,说明表达的抗体具有生物活性。以携带荧光蛋白基因的重组腺病毒载体AD359-EGFP为对照,用新型Ad/AAV嵌合载体A/V659-EGFP感染NK92细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,发现对照组的GFP蛋白表达情况在第6天时发生减弱,但新型嵌合载体感染的细胞GFP可以长效表达。因此我们可以把携带抗体基因的新型病毒载体和NK细胞联合使用,利用NK对肿瘤细胞的天然靶向性,携带病毒载体在肿瘤细胞周围富集,从而使抗体在肿瘤中大量长效表达,达到杀死肿瘤的目的,为以后的临床应用打下了基础。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-14
缩略词表  14-15
第一章病毒载体及抗体基因治疗综述  15-23
  1.1 应用于肿瘤基因治疗中的病毒载体  15-17
  1.2 Ad/AAV 嵌合腺病毒载体  17-19
    1.2.1 Ad/AAV 嵌合病毒载体的特点  18-19
    1.2.2 Ad/AAV 嵌合腺病毒载体生产  19
  1.3 抗体基因治疗现状  19-20
    1.3.1 单克隆抗体的研究进展  19-20
    1.3.2 Cetuximab 的研究进展  20
  1.4 实验设计方案及课题内容  20-23
    1.4.1 本课题研究目的和意义  20-21
    1.4.2 实验设计方案和流程  21-22
    1.4.3 课题创新点  22-23
第二章携带Cetuximab(AT2)蛋白基因Ad/AAV 病毒载体的构建  23-48
  2.1 实验器材  23-28
    2.1.1 材料  23
    2.1.2 仪器和设备  23-24
    2.1.3 试剂及试剂盒  24-25
    2.1.4 主要试剂的配制  25-27
    2.1.5 所用引物  27
    2.1.6 所用LINKER  27-28
  2.2 实验方法  28-42
    2.2.1 用于融合的个基因片段的获得  28-29
    2.2.2 重组质粒pDC659 载体构建  29-34
    2.2.3 重组质粒pDC659-nAT2 载体构建  34-35
    2.2.4 重组质粒pDC659-EGFP 载体构建  35-37
    2.2.5 重组质粒pDC659-EGFP 及pDC659-nAT2 载体的大量抽提  37
    2.2.6 病毒重组、扩增和纯化  37-42
  2.3 结果  42-46
    2.3.1 用于重组质粒pDC659-EGFP、pDC659-nAT2 载体构建的电泳结果  42-45
    3.3.2 重组腺病毒的鉴定  45-46
    2.3.3 病毒滴度测定  46
  2.4 讨论  46-47
  2.5 小结  47-48
第三章新型AD/AAV 嵌合病毒抗肿瘤效果评估  48-58
  3.1 实验器材  48-50
    3.1.1 实验所需材料  48
    3.1.2 实验所需仪器  48-49
    3.1.3 实验所需主要试剂  49
    3.1.4 主要试剂的配制  49-50
  3.2 实验方法  50-53
    3.2.1 细胞培养  50
    3.2.2 ELISA 方法检测蛋白的表达量  50-51
    3.2.3 Western Blot 方法检测蛋白的表达  51-52
    3.2.4 A/V659-EGFP 和AD359-EGFP 在NK92 细胞中的表达  52-53
  3.3 实验结果  53-56
    3.3.1 酶联接免疫吸附实验(ELISA)  53
    3.3.2 Western Blot 检测  53-54
    3.3.3 AD359-EGFP 和A/V659-EGFP 在NK92 细胞中的表达  54-56
  3.4 讨论  56-58
结论  58-59
参考文献  59-61
致谢  61

新型Ad/AAV嵌合病毒携带全长抗体基因对肿瘤治疗作用的研究

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