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中红侧沟茧蜂气味结合蛋白Mmed OBP8的气味结合特征及行为反应验证

作　者: 张康
导　师: 王沫；张永军
学　校: 华中农业大学
专　业: 农药学
关键词: 中红侧沟茧蜂植物挥发物气味结合蛋白MmedOBP8 荧光竞争结合表达谱三维结构趋性反应田间诱集
分类号: S476.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

昆虫的触角系统是一个高度特异和极其灵敏的化学探测器,触角中相关的嗅觉蛋白可以识别环境中的特异性化学气味分子,并依此引导昆虫觅食、寻偶、定位寄主植物、庇护、选择产卵场所等行为,嗅觉相关蛋白对于昆虫与外界进行信息交流具有重要意义。中红侧沟茧蜂是一种寄主范围非常广泛的内寄生蜂,在农业生产中,广泛用于棉铃虫等鳞翅目害虫的生物防治。在植物-植食性昆虫-天敌的三级营养链中,天敌昆虫如何利用嗅觉系统准确识别寻找到寄主昆虫是一个重要的环节。本文以天敌昆虫中红侧沟茧蜂的嗅觉识别机制为切入点,室内室外试验相结合,从分子生物学和化学生态学角度对中红侧沟茧蜂的嗅觉识别功能进行了研究,主要研究结果如下：1.成功构建中红侧沟茧蜂触角cDNA文库,利用生物信息学技术比对分析后,鉴定获得10个气味结合蛋白基因(OBPs)、1个化学感受蛋白(CSPs)基因和34个气味受体基因(ORs)；2.运用Real-time PCR技术研究了MmedOBP8基因(GenBank登录号：JF738026)在中红侧沟茧蜂不同组织部位的表达谱。结果发现,MmedOBP8主要在雌虫触角中表达,在雌虫触角占56.8%,雄虫触角占18.6%,其余部位均较低。3.克隆、表达和纯化MmedOBP8,得到不含His标签的高纯度MmedOBP8重组蛋白。以1-NPN为荧光探针,通过荧光竞争结合试验,解析了MmedOBP8重组蛋白与100种气味分子的结合能力。结果显示,MmedOBP8的结合谱较广,能够结合多数参试气味分子。其中癸烷、壬烷、十一醛、乙酸乙酯、辛酸乙酯、2-十一烷酮、1-壬醇、金合欢醇、丁酸已酯、正辛烷、丁酸反-2-己烯酯、2-葵酮、2-壬酮、金合欢烯、罗勒烯、α-水芹烯、橙花叔醇与MmedOBP8的结合常数均在10μM以下,结合能力较强；4.采用同源建模的方法预测了MmedOBP8的三维结构并对结合位点进行了预测。结果显示,MmedOBP8的三维结构中大部分为疏水性氨基酸,但同时在其结合口袋内部存在6个亲水性氨基酸Gln3, His7, Asp45, Glu63, Gln65, Glulll;5.室内采用“Y”型嗅觉仪测定中红侧沟茧蜂成虫对60种不同的植物挥发物趋性行为反应。结果显示,中红侧沟茧蜂趋向于选择脂肪族化合物,其次是萜类化合物,对芳香族化合物反应较弱。其中对(Z)-3-己烯乙酸酯、β-紫罗兰酮、2-十一烷酮、己醛、正辛醇、罗勒烯、橙花叔醇和香叶醇等气味的选择性最高,选择率分别为80.7%、73.2%、70.9%、69.6%、67.8%、74.1%、71.2%、67.9%,与对照相比差异极显著(P<0.01)；6.将荧光竞争结合试验结果与室内行为反应试验结果相结合,筛选出(Z)-3-己烯乙酸酯、β-紫罗兰酮、2-十一烷酮、1,4-二甲基苯、罗勒烯和橙花叔醇等气味分子分别制成诱芯进行了田间罩笼诱集试验。结果显示,中红侧沟茧蜂对罗勒烯和(Z)-3-己烯乙酸酯的选择性最高,校正选择率分别为18.6%和14%,显著高于与其它化合物,6种化合物田间条件下对中红侧沟茧蜂的吸引能力强弱顺序为：罗勒烯>(Z)-3-己烯乙酸酯>β-紫罗兰酮>橙花叔醇>1,4-二甲基苯>2-十一烷酮。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-22
  1 中红侧沟茧蜂简介  11
  2 中红侧沟茧蜂触角感器研究进展  11-13
  3 挥发性化学信息物对寄生蜂的影响  13-15
    3.1 昆虫挥发性化学信息物  13-14
    3.2 植物挥发性化学信息物  14-15
  4 昆虫气味结合蛋白研究进展  15-18
  5 昆虫化学感受蛋白研究进展  18-19
  6 昆虫气味受体  19
  7 植物性挥发化合物在生物防治中的应用和前景  19-20
  8 研究的意义与目的  20-22
    8.1 研究意义  20-21
    8.2 研究目的  21-22
第二章中红侧沟茧蜂MmedOBP8表达谱的构建及三维结构解析  22-29
  1 材料与方法  22-25
    1.1 供试昆虫与试剂  22
    1.2 试验仪器  22
    1.3 中红侧沟茧蜂MmedOBP8的三维结构及结合位点预测  22-23
    1.4 总RNA的提取  23
    1.5 第一链cDNA的合成  23-24
    1.6 引物及探针合成  24
    1.7 荧光定量PCR  24
    1.8 目的基因和内参基因扩增效率一致性的验证  24-25
    1.9 数据处理  25
  2 结果与分析  25-27
    2.1 目的基因与内参基因扩增一致性验证  25
    2.2 中红侧沟茧蜂MmedOBP8在成虫各组织部位的表达  25
    2.3 中红侧沟茧蜂MmedOBP8的表达谱分析  25-26
    2.4 中红侧沟茧蜂MmedOBP8三维结构及结合位点预测  26-27
  3 小结与讨论  27-29
第三章中红侧沟茧蜂MmedOBP8的克隆、表达、纯化  29-36
  1 材料与方法  29-32
    1.1 供试昆虫与试剂  29
    1.2 中红侧沟茧蜂MmedOBP8蛋白克隆、表达和纯化  29-32
      1.2.1 样品的制备  29
      1.2.2 中红侧沟茧蜂MmedOBP8基因克隆  29-31
      1.2.3 中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP8的表达和纯化  31
      1.2.4 重组蛋白PET/MmedOBP8 His-tag的切除  31-32
  2 结果与分析  32-35
    2.1 中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP8序列分析  32
    2.2 中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP8的克隆、表达和纯化  32-35
  3 小结与讨论  35-36
第四章 MmedOBP8的气味分子结合特征  36-47
  1 材料与方法  36-40
    1.1 供试昆虫与试剂  36-39
    1.2 中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP8的表达和纯化  39
    1.3 重组气味结合蛋白MmedOBP8荧光特征  39-40
    1.4 重组气味结合蛋白MmedOBP8与气味化合物的结合试验  40
  2 结果与分析  40-46
  3 小结与讨论  46-47
第五章植物挥发性气味物质对中红侧沟茧蜂的趋向行为影响及田间诱集效果  47-57
  1 材料与方法  47-51
    1.1 供试棉花及昆虫  47
    1.2 挥发性气味物质样品制备  47-50
    1.3 中红侧沟茧蜂对挥发性气味物质的趋性行为测定  50
    1.4 田间罩笼内挥发性气味物质对中红侧沟茧蜂的引诱测定  50-51
    1.5 数据统计与分析  51
  2 结果与分析  51-55
    2.1 中红侧沟茧蜂对挥发性气味物质的选择反应  51-55
    2.2 田间罩笼内挥发性气味物质对中红侧沟茧蜂的引诱作用  55
  3 小结与讨论  55-57
参考文献  57-64
致谢  64-65
附录攻读硕士学位期间发表的学术论文  65

中红侧沟茧蜂气味结合蛋白Mmed OBP8的气味结合特征及行为反应验证

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