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共轭亚油酸对TLR4信号通路相关基因表达的影响

作　者: 周先
导　师: 伍晓雄
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 免疫应激 共轭亚油酸 Toll样受体4 脂多糖
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 24次
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内容摘要


共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是一种天然的功能性脂肪酸,具有减少体脂、提高动物生产性能、改善胴体性状等特殊生理功能,尤其可提高动物机体的免疫力,因而受到广泛的关注。Toll样受体是连接机体固有免疫与获得性免疫的纽带,在抗感染和免疫调节方面发挥重要作用,而有关CLA对TLR4及其相关信号转导的调节报道较少。本试验分别在动物与细胞水平上进行了研究,旨在通过研究CLA对TLR4信号通路相关基因表达的影响,进一步阐明CLA免疫调控机制。(一)动物试验60只SPF级22-23g雄性昆明小鼠,随机分为试验组和对照组,分别饲喂添加1%CLA和1%大豆油的小鼠饲料。试验期30d后通过给小鼠腹腔注射细菌内毒素(lipopolysaccharide, LPS) (4mg/kg)建立免疫应激模型,分别于0h、1.5h、3h、6h、12h采集小鼠脾脏,采用RT-PCR分析其TLR4 (Toll-Like Receptor 4)、MyD88(myeloid differentiation factor 88)、TRIF(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β)、NFKB-p65 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)的表达水平。试验结果表明：注射LPS后上述各基因表达量升高,均在6h达到峰值。试验组脾脏TLR4、MyD88、TRIF的mRNA表达量低于对照组,在6h时达到显著效果(P<0.05),但NFκB-P65的显著效果(P<0.05)出现在3h时。(二)细胞试验设置空白对照组(DMSO)、低剂量组(50μmol/L CLA-DMSO)、高剂量组(100μmol/L CLA-DMSO)的DMEM细胞培养液培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,培养24h后加入LPS(100ng/mL)诱发产生免疫反应,分别于0h、2h、4h、8h后收集细胞,采用RT-PCR分析其TLR4、MyD88、TRIF、NFκB-P65的表达水平。试验结果表明：加入LPS后上述各基因的表达量均升高,在4h达到峰值。试验组上述四基因的表达量均低于空白对照组,浓度为100μmol/L的高剂量组显著低于空白对照组(P<0.05)。结论：CLA可有效抑制LPS诱发的TLR4信号通路中TLR4、MyD88、TRIF、NFκB-p65的表达,提示CLA对机体免疫的调控可能与此通路有关。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语  9-10
一 前言  10-21
  1 免疫应激及其对动物的影响  10
  2 共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)及其功能  10-16
    2.1 CLA的结构和来源  10-11
    2.2 CLA的吸收与代谢  11
    2.3 CLA的生理功能  11-16
      2.3.1 CLA的抗癌作用  11-12
      2.3.2 CLA的抗动脉粥样硬化作用  12
      2.3.3 CLA的抗Ⅱ型糖尿病  12-13
      2.3.4 CLA对骨代谢的调节  13
      2.3.5 CLA降低脂肪沉积的作用  13-14
      2.3.6 CLA对机体免疫的调控  14-16
  3 TOLL样受体(Toll-Like Receptors,TLRs)  16-21
    3.1 TLRs的结构  17
    3.2 TLRs的分类和分布  17-18
    3.3 TLRs的配体  18
    3.4 TLRs介导的信号传导  18-21
      3.4.1 MyD88依赖途径  19
      3.4.2 TRIF信号通路/MyD88非依赖途径  19-20
      3.4.3 TLRs的负调控物  20
      3.4.4 LPS与TLR4  20-21
二 研究目的及意义  21-22
三 材料与方法  22-34
  1 材料  22-25
    1.1 试验动物及细胞  22
    1.2 试剂  22-23
    1.3 常规试剂的配制  23-24
    1.4 主要仪器  24-25
  2 方法  25-34
    2.1 动物试验方法  25-32
      2.1.1 动物饲养与管理  25
      2.1.2 小鼠免疫应激模型建立  25-26
      2.1.3 总RNA的提取  26
      2.1.4 组织总RNA的纯化  26-27
      2.1.5 组织RNA的检测及浓度测定  27
      2.1.6 逆转录cDNA第一链合成  27-28
      2.1.7 普通PCR扩增  28-29
      2.1.8 荧光定量PCR  29-32
    2.2 细胞试验方法  32-34
      2.2.1 RAW264.7巨噬细胞复苏与冻存  32
      2.2.2 细胞培养  32
      2.2.3 免疫模型复制  32-33
      2.2.4 细胞总RNA提取、纯化、逆转录、荧光定量、统计分析  33-34
四 结果与分析  34-44
  1 动物试验结果与分析  34-38
    1.1 脾脏总RNA提取及检测  34
    1.2 逆转录脾脏cDNA质量检测  34-35
    1.3 荧光定量退火温度  35
    1.4 脾脏TLR4信号通路各基因相对表达量  35-36
    1.5 CLA对小鼠脾脏TLR4、MyD88、TRIF、NFκB-p65表达的影响  36-38
  2 细胞试验结果与分析  38-44
    2.1 RAW264.7巨噬细胞总RNA提取及检测  38-39
    2.2 逆转录巨噬细胞cDNA质量检测  39
    2.3 荧光定量退火温度  39
    2.4 TLR4信号通路各基因相对表达量  39-41
    2.5 CLA对RAW264.7巨噬细胞TLR4、MyD88、TRIF、NFκB-p65表达的影响  41-44
五 讨论  44-46
六 结语  46-47
  1 结论  46
  2 本研究的创新之处  46
  3 本研究的不足之处  46-47
参考文献  47-54
致谢  54

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 饲料
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