学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

人Midkine的克隆、原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究

作　者: 杜丽娟
导　师: 韩伟; 孙群
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化工
关键词: 中期因子Midkine 基因原核表达蛋白质纯化骨髓造血
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 10次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

中期因子(Midkine,简称MK)是一种肝素结合性生长分化因子。在胚胎期,MK在组织中广泛分布,在成人体内,其表达降低,仅局限于某些特定部位,MK受体种类繁多,信号通路复杂多样,这就决定了MK功能的多样化,它能促进很多种类细胞的生长、存活、分化和迁移,具有抗细胞凋亡的作用,不仅与肿瘤发生密切相关,而且在很多组织的发育形成及损伤后的修复再生过程均有参与,MK已成为恶性肿瘤在内的多种疾病治疗中颇具前景的分子靶点。应用全基因组表达芯片,我们对小鼠骨髓再生过程中骨髓全基因组表达谱作了系统研究,发现中期因子Midkine的表达呈现显著的先上升后下降的趋势,我们预测MK的基因表达与骨髓损伤和修复相关。本课题拟制备人Midkine重组蛋白,研究其对小鼠骨髓造血的调控作用。本研究从该基因克隆开始,构建了原核表达重组质粒,在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达,经过蛋白变性与复性后,经阳离子交换层析过柱纯化,通过Western Blot鉴定了该重组蛋白,并测定重组蛋白的生物学活性和内毒素含量。将重组蛋白注射正常小鼠,研究其对骨髓造血的调控作用。本研究的主要结果和结论如下:通过PCR方法从人骨髓cDNA文库中克隆得到人中期因子Midkine成熟肽目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳验证片段大小约380bp大小,将回收产物克隆到pET30a(+)空载体中构建重组质粒pET30a(+)-hMidkine;转化到非表达宿主菌DH5α后,菌落PCR方法和酶切法筛选鉴定,测序证明与Midkine成熟肽基因序列一致。将重组质粒pET30a(+)-hMidkine转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经过蛋白表达的优化,确定最佳的诱导条件为42℃诱导3小时,Kana浓度为100ug/mL的LB培养基,IPTG浓度为1mmol/L。用IPTG诱导400mL菌液,蛋白主要以包涵体形式存在,分子量大小16kDa。离心获得菌体,经超声和溶菌酶双重破菌后,洗涤包涵体,用6M盐酸胍进行包涵体变性,在pH7.4的复性液中进行稀释复性,复性后的蛋白溶液PH调为8.0,经Sp-Sepharose阳离子交换层析后获得目的蛋白溶液。BSA蛋白定量法测得其浓度可达0.8mg/mL,银染和SDS-PAGE鉴定结果表明重组蛋白纯度大于99%,计算蛋白得率,400mL初始菌液获得了9.3mg的重组蛋白。测定重组蛋白的内毒素含量和生物学活性,用显色基质鲎试剂盒测定蛋白的内毒素含量小于0.2EU/ug,通过MTT法检测表明rhMK蛋白具有体外促小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的活性。用重组蛋白注射正常小鼠进行药效学研究,结果发现Midkine重组蛋白作用后小鼠的外周血白细胞和血小板显著升高,而骨髓细胞总数显著降低,提示外源性hMidkine在小鼠体内可能促进了骨髓细胞向外周血迁移,hMidkine也可能具有动员骨髓造血干祖细胞到外周血的功能。本课题为进一步研究Midkine在调节骨髓造血系统的作用和作用机理奠定了实验基础。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-15
第一章绪论  15-19
第二章材料  19-27
  2.1 实验仪器与设备  19-20
  2.2 主要试剂与配制  20-27
    2.2.1 常规试剂  20-22
    2.2.2 质粒与菌株  22
    2.2.3 细菌培养基  22
    2.2.4 蛋白电泳缓冲系统  22-23
    2.2.5 重组蛋白分离纯化溶液  23
    2.2.6 质粒提取溶液配制  23
    2.2.7 Western blot 相关试剂的配制  23-24
    2.2.8 内毒素测定相关溶液及试剂  24
    2.2.9 动物实验相关材料  24-25
    2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期相关试剂和材料  25
    2.2.11 造血祖细胞集落培养相关试剂和溶液配制  25-27
第三章方法  27-55
  3.1 hMidkine 的克隆、表达、纯化与生物活性分析  27-44
    3.1.1 感受态细胞制备(CaCl_2法)  27
    3.1.2 大肠杆菌转化  27-28
    3.1.3 pET30a(＋)质粒抽提(碱裂解法)  28
    3.1.4 hMK PCR 引物设计  28-29
    3.1.5 PCR 反应  29-30
    3.1.6 DNA 琼脂糖凝胶电泳  30-31
    3.1.7 PCR 产物割胶回收  31-32
    3.1.8 hMK 片段与pTA2 vector 的连接  32-33
    3.1.9 质粒酶切  33-34
    3.1.10 目的基因片段和载体片段连接  34
    3.1.11 连接产物转化大肠杆菌  34
    3.1.12 双酶切检测目的基因和测序  34-35
    3.1.13 pET30a(＋)-hMK 重组质粒转化BL21 菌株  35
    3.1.14 hMK 诱导表达条件优化  35
    3.1.15 hMK 的诱导表达  35-36
    3.1.16 包涵体的分离和洗涤  36
    3.1.17 包涵体的变性和复性  36-37
    3.1.18 Sp-Sephorose 阳离子交换层析  37-38
    3.1.19 Bradford 法测蛋白溶液浓度  38
    3.1.20 蛋白样品SDS-PAGE  38-40
    3.1.21 Western blot 检测前述强离子交换柱纯化的蛋白的抗原性  40-41
    3.1.22 SDS-PAGE 及银染法分析前述强离子交换柱纯化的人MK 重组蛋白的纯度  41-43
    3.1.23 人MK 重组蛋白生物学活性测定  43-44
    3.1.24 显色基质法测蛋白内毒素含量  44
  3.2 phCMV 和mMidkine 质粒的制备  44-48
    3.2.1 phCMV-mMK 的克隆  44-46
    3.2.2 质粒大量抽提  46-48
    3.2.3 用分光光度计测双链DNA 的浓度  48
  3.3 动物实验  48-55
    3.3.1 phCMV-mMK 质粒注射正常小鼠  48-49
    3.3.2 外周血检测  49
    3.3.3 骨髓细胞采集及计数  49-50
    3.3.4 重组蛋白rhMK 注射正常小鼠  50-51
    3.3.5 股骨切片及HE 染色  51-53
    3.3.6 流式细胞仪检测骨髓单个核细胞周期  53-54
    3.3.7 造血祖细胞集落培养  54-55
第四章结果  55-68
  4.1 hMK 的基因克隆及蛋白表达纯化结果  55-64
    4.1.1 PCR 产物扩增结果  55
    4.1.2 hMK-pTA2 酶切及测序结果  55-56
    4.1.3 pET30a(+)-hMK 酶切鉴定结果  56
    4.1.4 hMK 诱导条件的优化  56-57
    4.1.5 hMK 重组菌诱导表达后包涵体的准备  57-58
    4.1.6 包涵体的溶解及蛋白变性复性结果  58
    4.1.7 hMK 过Sp-Sepharose 柱纯化结果  58-59
    4.1.8 重组hMK 蛋白的SDS-PAGE 电泳鉴定  59-60
    4.1.9 蛋白样品的透析  60
    4.1.10 纯化得到的rhMK 蛋白纯度验证  60-61
    4.1.11 Bradford 法测定重组蛋白的浓度  61-62
    4.1.12 纯化过程中蛋白产量和得率的计算  62
    4.1.13 Western blot 检测纯化得到的蛋白的抗原性  62-63
    4.1.14 重组蛋白rhMK 活性测定结果  63-64
    4.1.15 重组蛋白内毒素含量测定  64
  4.2 动物实验结果  64-68
    重组hMK 蛋白注射正常小鼠后对骨髓造血系统的作用  64-68
第五章讨论  68-71
参考文献  71-80
文献综述  80-93
参考文献  93-95
致谢  95-96
硕士期间发表的论著  96

人Midkine的克隆、原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究

内容摘要

全文目录

相似论文