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新型抗凝药物DTI解毒剂的研究及凝血调节蛋白在树突状细胞中作用机制的初步探索

作　者: 晁叶青
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 凝血酶解毒剂凝血调节蛋白树突状细胞
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

当发生血管破裂等组织损伤时，机体内最先被激活的防御机制是凝血级联反应，即由组织因子激活到最终形成一个纤维蛋白交联的凝块的过程。在这个反应过程中，最重要的部分是生成凝血酶及凝血酶催化纤维蛋白酶原形成纤维蛋白。许多与凝血异常相关的疾病都与凝血酶的功能失常相关。因此，凝血酶是研究抗凝药物的一个有效靶点。最近，一类新的抗凝药物，凝血酶的直接抑制剂（DTI）被研发出来，这类抗凝药物包括小分子的Argatroban及可以口服的diabigatran等。与传统的抗凝药物华法林（warfarin）相比，这类新的抗凝药物DTI具有很多优点，例如，DTI几乎没有与其它药物或食物间的交叉反应，而且病人服药后不需要定期的去医院做抗凝实验检测。新型抗凝药物DTI将会取代现在的传统抗凝治疗方法，然而目前阻碍其广泛的临床应用的一个最大的原因是其用药的安全性问题。因为目前还没有一个有效的解毒剂可以快速抵消DTI的药效，当服用DTI的病人发生大出血或需要紧急的外科手术时这样的解毒剂显得尤为必需。为了填补这个空缺，本研究根据凝血酶的结构与功能之间的关系设计了三个凝血酶的突变体（S195A，S195A/Y76A，S195A/Y76A/R101A）做为DTI解毒剂的候选者。S195A几乎不具有凝血酶的催化活性，它包含了凝血酶活性中心（S195）的一个单位点氨基酸的突变。体外凝血实验的结果表明S195A能够使血浆的凝血能力有效恢复，可以做为argatroban和diabigatran的解毒剂。为了使凝血酶突变体在体内的使用更为安全，在S195A的基础上对这个解毒剂（凝血酶突变体）进行了进一步的优化。另外的两个氨基酸突变位点（Y76，R101）被引入到凝血酶突变体S195A中，目的是使DTI为其唯一底物，并且这个凝血酶突变体不改变血浆的内源性凝血酶的生理活性。可以实时监测血浆内凝血酶生成的thrombinoscope创新性技术被用来对S195A/Y76A及S195A/Y76A/R101A做为解毒剂的拮抗能力进行检测。结果表明S195A/Y76A/R101A可以做为DTI的解毒剂的候选者，而S195A/Y76A似乎并不具备这个特性。原因可能是当将S196、Y76这两个突变位点同时放入凝血酶中时，引起了凝血酶结构上的一些改变，导致DTI在凝血酶上的识别位点被封闭。本研究成功地筛选出了S195A、S195A/Y76A/R101A做为DTI解毒剂的候选者。在一系列更多的体内和体外实验完成后，最终目的是将这个凝血酶突变体做为一个有效和安全的药物在临床上投入使用。凝血调节蛋白（Thrombomodulin, TM）是凝血级联路经中的另一个重要的蛋白，它在凝血系统中起到一个抗凝的作用。最近，越来越多的研究表明凝血调节蛋白还可以做为一个抗炎症的蛋白在免疫系统中发挥作用，并且猜测其抗炎反应的功能与lectin结构域相关，但是作用机制目前并不清楚。树突状细胞（dentritic cell, DC）是一类抗原递呈细胞，它是由骨髓干细胞分化而来，迁移到其他器官中摄取，加工处理和呈递抗原。DC中有一亚类可以表达TM蛋白，叫做BDCA3+DC。BDCA3+DC在体内含量的增高与哮喘，疟疾及癌症相关。本研究从小鼠中分离骨髓干细胞，并用诱导其在体外分化为树突状细胞（Bone marrow derived dendritic cells, BMDC）。在小鼠BMDC中表达TM的细胞约占1.9%左右。为了研究TM与树突状细胞间的作用机制，构建并纯化了TM-mfc, letin-mfc及mfc重组融合蛋白。在技术上的创新点为，构建融合蛋白的重组质粒时使用UCOE载体有效避免了外源基因整合到CHO-S细胞染色体上之后的基因沉默。蛋白C激活实验及HMGB1结合实验结果验证了融合蛋白TM-mfc，lectin-mfc具有和天然蛋白相似的功能。将融合蛋白与BMDC共同孵育后，TM-mfc可以使BMDC由免疫反应性变为耐受性，但是lectin结构域在其中所起到的作用目前仍旧不清楚。理解TM与树突状细胞之间的作用机制有助于为相关疾病提供新的疗法及新的药物靶点。为了更清晰地理解TM与树突状细胞之间的作用机制与信号通路，更多的实验正在进行中。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-41
  1.凝血系统综述  13-31
    概述  13-14
    1.1 血小板的激活  14-17
      1.1.1 胶原质激活血小板的机制  15-16
      1.1.2 凝血酶诱导的血小板聚集  16-17
      1.1.3 二磷酸腺苷（ADP）诱导血小板聚集  17
    1.2 凝血途径  17-20
      1.2.1 内源性凝血途径 Contact activation pathway （intrinsic）  19-20
      1.2.2 外源性凝血途径 Tissue factor pathway （extrinsic）  20
      1.2.3 最终的共同途径 Final common pathway  20
    1.3 凝血系统中的正负反馈途径及一些重要的凝血因子  20-29
      1.3.1 组织因子（Tissue factor, TF）  24
      1.3.2 凝血酶（Thrombin）  24-25
      1.3.3 纤维蛋白酶原（Fibrinogen）  25-26
      1.3.4 凝血因子 XIII（Factor XIII）  26
      1.3.5 蛋白 C（protein C）  26-27
      1.3.6 凝血调节蛋白（thrombomodulin, TM）  27-29
    1.4 凝血异常的相关疾病  29-31
  2.凝血酶与凝血酶的抑制剂  31-38
    2.1 凝血酶的结构  31-33
    2.2 凝血酶的直接抑制剂  33-38
  3.凝血系统与免疫系统的相互联系  38-41
第二章凝血酶直接抑制剂 DTI 的解毒剂的制备及其作用  41-92
  1.前言  41-42
  2.材料与方法  42-65
    2.1 凝血酶突变体质粒的构建  42-51
      2.1.1 设计凝血酶突变体  42-45
      2.1.2 利用定点突变技术获得凝血酶突变体质粒  45-51
    2.2 CHO-S 细胞的转染及阳性克隆的筛选  51-57
      2.2.1 CHO-S 细胞的培养  51-53
      2.2.2 Lipofectamin 2000 转染 CHO-S 细胞  53
      2.2.3 筛选转染后的阳性克隆细胞  53-57
    2.3 凝血酶重组蛋白的表达及纯化  57-61
    2.4 凝血实验  61-65
      2.4.1 APTT 试验  62
      2.4.2 TT 试验  62-63
      2.4.3 Thrombinoscope 试验  63-65
  3.结果与讨论  65-92
    3.1 凝血酶突变体质粒在 CHO-S 中的转染及阳性克隆的筛选  65-68
    3.2 凝血酶突变体重组蛋白的表达及纯化  68-80
    3.3 凝血实验  80-92
      3.3.1 S195A  80-87
      3.3.2 S195A/Y76A  87-89
      3.3.3 S195A/Y76A/R101A  89-92
第三章凝血调节蛋白的制备及其对树突状细胞的作用  92-118
  1.前言  92-94
  2.材料方法  94-106
    2.1 构建重组表达载体  94-98
    2.2 CHO-S 转染及阳性克隆的筛选  98-100
    2.3 重组蛋白的表达与纯化  100
    2.4 TM-mfc 重组蛋白的功能检测  100-106
      2.4.1 aPC assay  100-101
      2.4.2 HMGB1 binding assay  101-102
      2.4.3 TM 重组蛋白与 BMDC 的孵育实验  102-103
      2.4.4 流式细胞仪分析（FACS）  103-106
  3.结果与讨论  106-118
    3.1 构建重组质粒  106-108
    3.2 阳性克隆的筛选  108-110
    3.3 重组蛋白纯化  110-111
    3.4 aPC assay  111-112
    3.5 HMGB1 binding assay  112-113
    3.6 流式细胞仪分析 TM 融合蛋白对 BMDC 的作用  113-118
      3.6.1 TM 在 BMDC 中的表达  113-115
      3.6.2 融合蛋白对 BMDC 的影响  115-118
总结与展望  118-120
参考文献  120-138
致谢  138-139
个人简介  139
发表的学术论文  139

新型抗凝药物DTI解毒剂的研究及凝血调节蛋白在树突状细胞中作用机制的初步探索

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