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IL-17A对肺纤维化中成纤维细胞表型转化的影响及可能机制

作　者: 康庆鑫
导　师: 张涛
学　校:
专　业: 内科学
关键词: IL-17A肺纤维化成纤维细胞肌成纤维细胞表型转化
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行肺成纤维细胞体外培养及鉴定,研究IL-17A对肺纤维化中成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响及可能机制,以探讨IL-17A在肺纤维化的形成和发展进程中所起的作用,为防治肺纤维化提供新的理论依据。方法：根据前期对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺纤维化形成过程中不同阶段IL-17RAmRNA表达趋势的研究,以IL-17RAmRNA表达最高的第14天模型小鼠作为本实验研究对象,博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型制作方法及过程同前期实验。取造模后第14天小鼠肺组织,采用差速离心和反复贴壁法相结合原代培养小鼠肺成纤维细胞,并传3代。倒置显微镜下观察培养过程中肺成纤维细胞的形态变化；间接免疫荧光法鉴定波形蛋白的表达。以IL-17A刺激原代培养并传3代的小鼠肺成纤维细胞,采用间接免疫荧光法检测小鼠肺成纤维细胞中a-SMA的表达及定位。采用Western blotting检测IL-17A刺激下不同时间点小鼠肺成纤维细胞中a-SMA、Actl、p65、P-p65、IkB-a及P-IKB-a蛋白的表达。结果：1、原代培养的肺成纤维细胞特征典型,并通过传代培养得到了纯化的肺成纤维细胞。培养细胞形态学变化：第3-4代细胞形态较为均一,呈长梭形,显微镜下可见1-2个核仁；细胞之间界限清晰,呈鱼群状或栅栏状排列。2、间接荧光免疫细胞化学鉴定结果：激光共聚焦显微镜下观察第3代细胞波型蛋白染色强阳性,胞浆呈深红色,且细胞之间有众多的胶原纤维相隔,可证实为肺成纤维细胞。3、肺成纤维细胞a-SMA的免疫荧光表现：在激光共聚焦显微镜下可见,未经IL-17A刺激的对照组肺成纤维细胞少数表达a-SMA荧光信号且荧光信号强度较弱,主要位于胞浆中；经IL-17A刺激后,a-SMA荧光信号的细胞表达数目及强度明显增强,而且细胞呈典型的梭形改变。4、Western blotting检测显示肺成纤维细胞在IL-17A (50ng/ml)刺激下,0h组有比较弱的a-SMA表达,1h组、2h组及4h组肺成纤维细胞中a-SMA表达均明显高于0h组(P<0.05)；与1h组相比,2h组及4h组肺成纤维细胞中a-SMA表达明显增高(P<0.05)；2h组与4h组之间肺成纤维细胞中a-SMA表达水平的比较无明显统计学差异(P>0.05)。1h组、2h组及4h组肺成纤维细胞中P-p65与P-lKB-a蛋白表达均明显高于Oh组(P<0.05)；与1h组相比,2h组及4h组肺成纤维细胞中P-p65与P-lKB-a蛋白表达明显降低(P<0.05)；2h组与4h组之间肺成纤维细胞中P-p65与P-lKB-a蛋白表达水平的比较无明显统计学差异(P>0.05)。不同时间点(OH、1h、2h及4h)肺成纤维细胞中均有p65、IKB-a与Actl蛋白的表达,但各时间点(0h、1h、2h及4h)之间肺成纤维细胞中p65、IkB-a与Actl蛋白表达水平的两两比较无明显统计学差异(P>0.05)。结论：1、应用差速离心和反复贴壁法成功地分离纯化培养了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺成纤维细胞,获得的细胞产量较大,是一种可靠的技术。通过间接免疫荧光法对小鼠肺成纤维细胞进行了鉴定,细胞免疫荧光染色波形蛋白阳性。第3代细胞适用于以肺成纤维细胞为观察对象的实验研究。2、IL-17A能通过促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化来参与肺纤维化的形成。3、IL-17A可能通过激活NF-kB信号转导通路,上调P-p65及P-IkB-a蛋白表达,将非磷酸化蛋白活化为磷酸化蛋白来促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,从而导致肺纤维化的发生及发展。

全文目录

英文缩略词表  5-8
摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-17
材料与方法  17-30
结果  30-35
讨论  35-51
结论  51-52
参考文献  52-62
综述  62-74
  参考文献  69-74
攻读学位期间发表的文章  74-75
致谢  75

IL-17A对肺纤维化中成纤维细胞表型转化的影响及可能机制

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