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MEPE蛋白质裂解活化在牙本质形成中的作用和机制研究

作　者: 陈兴兴
导　师: 肖明振; 余擎; 王捍国; 张健
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 细胞外基质磷酸化糖蛋白裂解活化蛋白质翻译后修饰成牙本质细胞牙本质矿化羟基磷灰石矿化双膜矿化系统
分类号: R780.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein，MEPE）最初是由Rowe等于2000年在肿瘤相关性低血磷性骨软化症（oncogenichypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者肿瘤组织的cDNA文库中筛选发现并克隆得到。正常组织中MEPE在骨组织、牙齿、骨髓和大脑中表达，在肺、肾以及人胎盘中有极低水平表达。MEPE在OHO患者肿瘤组织中高表达，因此被认为是引起低血磷性骨软化症的调磷因子。MacDougall.M等通过RT-PCR发现MEPE/OF45在牙体组织尤其是成牙本质细胞中表达，首次证实MEPE在牙本质形成过程中表达，与牙齿硬组织发育相关；基因定位位于染色体4q21.1，是多种牙本质发育异常疾病的可能致病基因。Hanguo Wang（王捍国）等在大鼠牙髓组织中检测到MEPE蛋白质的三种形式，即全长、N端和C端片段，认为牙髓细胞合成分泌的MEPE被裂解成N端和C端两个片段分泌至牙本质细胞外基质，C端为其活性形式。然而，形式的蛋白质是否具有不同作用，可否调控成牙本质细胞的分化，如何参与牙本质形成和矿化，尚未见报道。本课题观察MEPE不同片段在牙齿发育过程中的时空表达，提示其不同作用；比较MEPE不同片段在细胞增殖、分化以及牙本质形成中的作用，确定MEPE的活性形式，进一步验证和充实MEPE裂解活化模型，从牙本质细胞外基质蛋白翻译后修饰的角度探讨牙本质形成的机制，以进一步研究MEPE在牙本质形成以及牙本质损伤修复中的作用和机理，为临床上牙髓病变活髓保存治疗、MEPE相关疾病的预防治疗提供理论依据。研究分为以下四部分内容：一、MEPE不同片段在牙齿发育过程中的时空表达本实验大量表达、纯化MEPE不同片段原核蛋白，制备特异性识别N端和C端片段的抗体，并制备小鼠牙齿发育过程中不同阶段组织切片，通过免疫组织化学染色法，比较MEPE不同片段在牙齿发育过程中的时空表达模式。结果显示在PND1牙胚未见MEPE表达，在牙齿发育早期阶段（PND3）可见MEPE主要表达于成牙本质细胞和成釉细胞，随着牙胚发育（PND5，PND7）在以上细胞中表达减弱，在前期牙本质中表达阳性。两种抗体识别的N端片段和C端片段蛋白表达定位无明显差异，提示三种形式的MEPE都可能参与牙本质形成。二、MEPE不同片段过表达稳定细胞系的生物学特性比较构建含有不同片段MEPE基因的慢病毒载体，包装病毒后感染成牙本质细胞建立过表达的稳定细胞系，比较过表达N端、C端片段的稳定细胞系的增殖、分化、矿化能力等生物学特性，并对照过表达MEPE全长的稳定细胞系，确定其功能性片段。结果表明，MEPE全长以及C端片段能促进细胞增殖，对于细胞分化和矿化具有抑制作用，而N段片段无明显作用。提示MEPE通过C端片段下调成牙本质细胞分化和矿化。三、MEPE不同片段的细胞生物学作用通过细胞培养和CCK-8检测方法、碱性磷酸酶实验以及茜素红染色实验，观察比较了不同浓度MEPE全长及C端片段蛋白质对成牙本质细胞增殖活性的影响。结果显示MEPE全长及不同浓度的C端片段对成牙本质细胞的增殖均有促进作用，对成牙本质细胞的碱性磷酸酶活性有抑制作用，抑制成牙本质细胞分化和矿化能力。实验还采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，用MEPE不同片段作用于矿化诱导的成牙本质细胞，检测整合素α2（ITGA2）、釉蛋白（ENAM）与转化生长因子β2（TGFB2）基因在成牙本质细胞分化过程中的表达情况，探讨MEPE不同片段在成牙本质分化过程中的作用。结果显示MEPE全长及C端片段作用下ITGA2、ENAM表达上调，TGFB2表达下调，提示MEPE全长及C端片段可能通过调节下游信号通路而对成牙本质细胞的增殖、分化以及牙本质形成发挥调节作用。四．MEPE不同片段在体外牙本质形成中的作用利用体外羟基磷灰石矿化双膜系统模型，观察MEPE蛋白全长及C端片段在体外对磷灰石晶体形成矿化的作用。结果显示，加入MEPE蛋白全长及C端片段后，阳离子膜表面生成了大量由弯曲的片状晶体构成的矿化球，并且片层状晶体表现为具有一定厚度的长方体形态。而BSA及DDW对照组中则无明显的矿化球形成，提示MEPE可能直接参与生物磷灰石晶体的成核。XRD结果显示加入MEPE和C端片段后衍射峰强度低于DDW对照组，提示MEPE全长及C端片段具有抑制晶体生长的作用。

MEPE蛋白质裂解活化在牙本质形成中的作用和机制研究

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