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microRNA-371-5p对结直肠癌细胞生物学特性的影响

作　者: 吕真冰
导　师: 丁彦青; 梁莉
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理与病理生理学
关键词: miR-371-5p SOX2 SOX17 结直肠癌
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景和目的结直肠癌是被确诊的第三常见肿瘤,在男性和女性肿瘤相关死因中居第三位,其在中国是第4位最常见的恶性肿瘤。随着生活水平的提高,发病率呈逐年上升和年轻化趋势。但是,其早期的症状往往不被人们所发现,确诊时,病人多已处于进展期。因此,识别有效的结直肠癌相关分子,研究其功能特点,不仅有利于很好的理解结直肠癌发生发展机制,而且也为临床诊断及治疗提供了新的靶点。microRNA对基因的转录后表达调控是21世纪的一个突破性科学发现,大量事实显示microRNA与肿瘤的发生及转移相关,通过抑制其靶基因的表达,发挥着“癌基因”或“抑癌基因”的作用。miR-371-5p,又称miR-371a-5p,是我们通过结直肠癌microRNA芯片筛选出的一个新的与肿瘤相关的microRNA,属于基因间microRNA,编码基因位于chr19：54,290,929-54,290,995,全长67bp.与基因内microRNA不同之处在于,其表达无宿主基因依赖而独立的受自身启动子活性状态的调控。目前为止,未见对miR-371-5p功能的研究,只是在尤文肉瘤,前列腺癌,胃癌的筛查或靶向治疗中有文献提到了miR-371-5p[3-5]。本研究将从miR-371-5p在人结直肠癌中的生物学作用入手,分析其下游作用靶基因及上游调控分子,并结合临床标本分析其表达与临床病理的关系。本研究不仅助于理解结直肠癌进展的分子机制,还为临床诊断及治疗提供了新的靶点。研究方法1.miR-371-5p在结直肠癌中生物学特性的研究1)利用结直肠癌组织microRNA芯片挑选出几个与结直肠相关的microRNA,并选取8种结直肠癌细胞株,利用real-time RT-PCR检测候选microRNAs的表达。2)利用阳离子脂质体法,将商品化的miR-371-5p inhibitor瞬时转染至结直肠癌细胞株SW480和HCT116中,通过体外增殖及侵袭实验研究miR-371-5p在结直肠癌中的作用,确定miR-371-5p为研究对象。3)设计并构建慢病毒载体,a、miR-371过表达载体进行病毒包装后将之感染至结直肠癌细胞株SW620和LoVo中,b、miR-371-5p/shRNA稳定干扰载体进行病毒包装后,将之感染至结直肠癌细胞株HCT116和SW480中；用有限稀释法筛选并获得稳定的细胞株,并行real-time RT-PCR检测miR-371-5p的表达。4)利用CCK8法、平板克隆形成、流式细胞仪和体外侵袭实验,检测过表达miR-371或稳定干扰miR-371-5p后对体外结直肠癌细胞增殖、侵袭能力的影响。5)利用整体可视化动物模型,检测过表达miR-371或稳定干扰miR-371-5p后对裸鼠皮下成瘤和转移能力的影响。6)从南方医院普外科收集77对新鲜结直肠癌组织及远端正常组织,利用实时荧光定量PCR检测miR-371-5p的表达情况及与临床病理的联系。2.miR-371-5p靶基因的筛选及验证1)以miR-371-5p为检索词,在microRNA.org、TargetScan、miRDB和DIANA-microT-CDS四个数据库进行靶基因的预测,将4个数据库得分前50的预测结果取交集,即预测得到的可信度和准确性较高的靶基因。2)利用萤光素酶报告系统检测miR-371-5p与筛选出的靶基因的结合情况,确定与microRNA直接作用的靶基因。3)利用real-time RT-PCR和Western blot方法,检测miR-371-5p和其靶基因在8种结直肠癌细胞株中的表达情况,并进行相关性分析；并检测了过表达或干扰miR-371-5p后靶基因的变化情况。4)将miR-371-5p稳定干扰细胞中干扰靶基因SOX2的表达,通过体外实验观察其对miR-371-5p在结直肠癌中生物学活性的逆转作用。3.miR-371-5p表达调控的探讨及其影响因素的排除1)利用甲基转移酶抑制剂氮杂胞嘧啶(5’AZC)及染料木素(Genistein),处理结直肠细胞株,与对照组比较miR-371-5p的表达情况。2)利用UCSC-Ensembl查找miR-371-5p茎环上游启动子序列并利用Methyprimer分析其启动子区域的CpG岛,通过在线软件PromotorScan预测其启动子区域,Consite在线软件预测与miR-371-5p启动子区域相互作用的转录因子。3)结合文献报道及软件分析结果,初定与miR-371-5p启动子区域相互作用的转录因子,利用real-time RT-PCR检测转录因子及miR-371-5p在结直肠癌细胞中的表达情况并行相关性分析；利用商品化的转录因子干扰片段将其瞬时干扰,检测其表达变化同时检测miR-371-5p的表达。4)利用real-time RT-PCR检测了miR-371-3p在结直肠细胞株及20对结直肠组织中的表达及干扰miR-371-3p后的体外实验并结合荧光素酶报告实验,排除了过表达miR-371细胞株中miR-371-3p对miR-371-5p实验结果的干扰。研究结果1.miR-371-5p在结直肠癌中生物学特性的研究1)通过microRNA芯片,我们挑选了2个候选microRNA(miR-92b、 miR-371-5p),real-time RT-PCR结果显示,miR-371-5p的表达在8种细胞株间的表达具有显著差异(F=320.581,p<0.001); miR-371-5p在HCT116细胞中的表达最高,且显著高于SW480、DLD-1、CoLa205、LS174T、HT29、SW620、 LoVo细胞中的表达(p=0.031,p=0.006,p=0.001,p<0.000,p=0.001,p=0.003,p=0.002)；miR-371-5p在SW480细胞中的表达显著高于HT29、 SW620和Lovo细胞中的表达(p=0.002,p<0.001,p<0.001)；miR-92b在8种细胞株间的表达具有显著差异(F=77.167,p<0.001),miR-92b在SW620细胞中的表达最高,且显著高于HCT116、SW480、DLD-1、CoLo205、LS174T、 HT29、LoVo细胞中的表达(p<0.001,p<0.001,p<0.001,p<0.001,p<0.001, p<0.001, p<0.001)。2)将商品化的靶点miR-371-5p inhibitor及miR-92b inhibitor分别瞬时转染至结直肠癌细胞株SW480、HCT116及SW620中发现,和blank及NC组相比较,转染了miR-371-5p inhibitor的细胞株SW480及HCT116的增殖能力明显增强(F=160.173,p<0.001；F=403.493,p<0.001),且体外侵袭能力增强(F=22.677,p<0.001；F=39.581,p<0.001)。而转染了miR-92b inhibitor的细胞株SW620的增殖能力及侵袭能力未见明显变化(结果未显示)。3)设计并构建慢病毒miR-371过表达载体及miR-371-5p/shRNA干扰载体,体外实验显示：过表达miR-371的SW620细胞及LoVo细胞的增殖能力显著减弱(F=570.960, p<0.001; F=1111.177, p<0.001),其侵袭能力亦显著减弱(t=3.776,p=0.005;t=3.414,p=0.009),过表达miR-371的LoVo细胞平板克隆形成能力减弱(t=4.832,p=0.008),而SW620细胞无明显变化(t=2.335,p=0.140); miR-371-5p/shRNA稳定干扰的HCT116细胞及SW480细胞的平板克隆形成能力显著增强(t=-3.033,p=0.039;t=-3.432, p=0.026). EMT相关分子检测中发现：比起NC组,miR-371-5p稳定干扰的的SW480细胞的E-cadherin表达下调,而Vimentin有轻度上调；比起mock组,过表达miR-371的LoVo细胞,E-cadherin表达显著上调,而Vimentin略微下调。在对miR-371-5p稳定干扰的的HCT116及SW480细胞行细胞周期的检测中发现,比起NC组,miR-371-5p干扰组在G1期的细胞百分数增加,G2/M期的细胞百分比降低(t=-5.363, p=0.006, t=-13.376, p<0.001;t=-3.417, p=0.027; t=4.694, p=0.009)。4)利用整体可视化动物模型观察到：比起mock组,miR-371过表达的LoVo细胞株皮下成瘤能力减弱(F=9.667,p=0.014),而稳定干扰miR-371-5p的HCT116细胞皮下成瘤能力,相对NC组而言虽有增强但无统计学差异(F=9.667,p=0.343)；稳定干扰miR-371-5p的HCT116细胞株肠转移(100%)及肝转移(75%)能力较NC组(40%,0%)强。5)利用实时荧光定量PCR检测了77对新鲜结直肠癌组织及远端正常组织miR-371-5p的表达,结果显示miR-371-5p在结直肠癌组织中的表达明显低于正常粘膜组织(t=-7.578,p<0.001)。临床病理分析结果显示：miR-371-5p与患者年龄、性别、肿瘤发生的部位、肿瘤分化程度、浸润深度以及肿瘤伴淋巴结转移均无显著关系(p=0.875；p=0.127；p=0.979,p=0.159,p=0.125；p=0.289)而在肿瘤的大小及有无肝转移上存在统计学差异(p=0.012,p=0.039)。2.miR-371-5p靶基因的筛选及验证1)由于microRNA对靶基因起抑制作用,结合microRNA的功能及四个数据库结果,初定miR-371-5p的靶基因为SOX2、SOCS5及BTG3。2)设计并构建SOX23’UTR、SOCS53’UTR及BTG33’UTR萤光素酶报告系统表达载体；结果显示,在HER293FT细胞SOX23’UTR及BTG33’UTR荧光素酶报告系统中,在转染miR-371-5p mimic组与对照blank组、NC组相比萤光素酶活性均显著降低(p<0.001,p<0.001；p<0.001,p<0.001),而在SOCS53’UTR荧光素酶报告系统中,转染miR-371-5p mimic组与blank组、NC组相比萤光素酶活性无明显变化(p=0.554,p=0.972)。在结直肠癌细胞株中转染BTG33’UTR萤光素酶报告系统HCT116细胞中,miR-371-5p/inhibitor组与blank组、NC组相比萤光素酶活性无显著差异(p=0.512,p=0.952),LoVo细胞株中转染miR-371-5p/mimics组与blank组、NC组相比萤光素酶活性无明显差异(p=0.773,p=0.621)。在结直肠癌细胞株中转染SOX23’UTR萤光素酶报告系统HCT116细胞中,miR-371-5p/inhibitor组与blank组、NC组相比萤光素酶活性增强(p=0.0004,p=0.0003), LoVo细胞株中转染miR-371-5p/mimics组与blank组、NC组相比萤光素酶活性减弱(p=0.041,p=0.034)。3)Western blot结果显示：在8种结直肠癌细胞株中SOX2在SW620细胞中表达最高,LoVo细胞中次之。在一定程度上,显示了miR-371-5p和SOX2之间存在着负相关关系；比起SW480/NC组,SW480/shRNA组SOX2的表达上调,而LoVo/miR-371组中SOX2的表达显著低于LoVo/mock组。4)miR-371-5p过表达能下调靶基因SOX2的表达,体外实验显示SOX2的干扰能部分逆转miR-371-5p干扰后在HCTT116及SW480细胞在细胞周期及体外侵袭上作用。3.miR-371-5p表达调控的探讨及排除miR-371-3p对miR-371-5p功能的影响1)甲基转移酶抑制剂氮杂胞嘧啶(5-aza-2’-deoxycytidine,AZA)及染料木素(Genistein)处理结直肠细胞株后：与NC组比较,miR-371-5p的表达在SW40、HCT116、HT29及LS174T细胞株中染料木素(genistein)处理组中显著上调(p=0.001,p=0.017,p=0.004,p=0.001),在SW40、HT29及LS174T细胞株中AZA处理组中上调具有统计学差异(p=0.009,p=0.040,p=0.007)；而染料木素(genistein)处理组的SW620及LoVo细胞株中及AZA组的HCT116、SW620及LoVo细胞株中miR-371-5p的表达无统计学差异(p=0.229,p=0.055,p=0.311,p=0.170,p=0.888)2)Methyprimer软件分析miR-371-5p上游2500bp启动子区域无明显CpG富集。Consite在线软件预测到的与miR-371-5p核心启动子区域相互作用的转录因子SOX17在结直肠癌中因启动子区域高度甲基化而表达下调。3)SW480细胞株中SOX17干扰后发现,与NC组比较,干扰组的SOX17表达明显下调且niR-371-5p的表达水平亦显著下调(F=226.053,p<0.001)。实时荧光定量PCR检查结直肠癌细胞株中SOX17及miR-371-5p表达后Spearman相关性分析显示,二者存在明显的正相关(r=0.749,p=0.032)。4) miR-371-3p对结直肠癌细胞的增殖、侵袭能力及SOX2双荧光素酶活性无明显作用且在结直肠癌组织中的表达与正常组织相比无统计学差异(p=0.472)。结论1、miR-371-5p在结直肠癌组织中表达下调,并抑制结直肠癌细胞的生长、侵袭及转移能力；2、miR-371-5p通过直接抑制靶基因SOX2的表达,在结直肠癌中发挥其生物学特性；3、转录因子SOX17正向调节miR-371-5p在结直肠癌细胞中的表达。本研究的创新之处：1、首次阐述miR-371-5p在肿瘤中的抑癌作用；2、提出SOX17/miR-371-5p/SOX2轴在结直肠癌侵袭和转移中的作用。

全文目录


摘要  3-10
ABSTRACT  10-21
前言  21-28
第一章 miR-371-5p在结直肠癌中的生物学特性的研究  28-67
  第一节 结直肠癌相关microRNA的筛选  28-39
    一、材料和方法  28-31
    二、结果  31-39
  第二节 miR-371-5p对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响  39-58
    一、材料和方法  39-43
    二、结果  43-58
  第三节 miR-371-5p在结直肠组织中的临床病理分析  58-62
    一、材料和方法  58-60
    二、结果  60-62
  讨论  62-67
第二章 miR-371-5p靶基因的筛选及验证  67-93
  第一节 miR-371-5p相互作用靶基因的预测与确定  67-85
    一、材料和方法  67-74
    二、结果  74-85
  第二节 SOX2逆转miR-371-5p在结直肠癌中的作用  85-89
    一、材料和方法  85-86
    二、结果  86-89
  讨论  89-93
第三章 miR-371-5p表达调控的初步探讨及排除miR-371-3p对miR-371-5p功能的影响  93-115
  第一节 miR-371-5p转录因子的识别  93-103
    一、材料和方法  94-96
    二、结果  96-103
  第二节 消除miR-371-3p对miR-371-5p在实验中的影响  103-111
    一、材料和方法  104-105
    二、结果  105-111
  讨论  111-115
参考文献  115-125
全文小结  125-127
攻读硕士学位期间研究成果  127-128
致谢  128-129

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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