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食管鳞癌中多肿瘤标记物表达的临床意义

作　者: 侯艳芳
导　师: 牛保华; 齐义军
学　校: 河南大学
专　业: 病理与病理生理学
关键词: 食管鳞状细胞癌 GRP94 MIF HSP27 生物标志物预后
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景恶性肿瘤是目前严重威胁人类健康的主要疾病之一，我国恶性肿瘤的发病人数约占全球20%，死亡人数约占全球24%。而食管癌（Esophageal carcinoma, EC）是世界上六大恶性肿瘤之一，其主要的流行病学特征是显著的地区分布差异，高低发区EC的发病率最大可相差500倍。河南省林州市是世界EC发病率及死亡率最高的地区之一，包括与其相邻的辉县及安阳等地。EC预后极差，中晚期病人的5年生存率仅为10%左右。大多的EC病人在临床确诊后平均生存时间不到一年，死亡率相当高。尽管近年来对EC进行了多学科的综合性研究，并提出EC的发生发展是一个多阶段多因素参与的复杂过程，但是，高发区的EC发病率及死亡率仍未得到明显的改善，到目前为止仍然是这些地区肿瘤相关死亡的主要原因之一。因此，阐明EC多阶段演变的分子机制，筛选及鉴定与EC癌变关系密切的预警分子，寻找高敏感、高特异的诊断标志物，寻找与鉴定新的治疗靶点，具有重要的理论意义，并为EC高发区高危人群提供重要的筛查、早期诊断、预后及治疗监测的生物标志物，以期降低EC发病率及病死率。我们课题组利用系统的蛋白质组学技术，包括二维电泳、稳定同位素标记（SILAC、iTRAQ）、二维液相色谱、ESI串联质谱、MALDI-TOF-TOF质谱等技术，全面鉴定了食管癌鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）蛋白差异表达谱。目前，我们已经鉴定了156个与ESCC发生发展密切相关的差异表达的蛋白质分子，如MIF（Macrophage migration inhibitory factor）、prohibitin、HSP27（Heat shock protein27）、annexin A2、GRP94(Glucoseregulated protein)、stratifin、CD（Cathepsin D）等。热休克蛋白HSP27是小分子热休克蛋白（Small heatshock protein，sHSP）亚家族中的主要成员之一，它的主要生物学功能是在各种应激因素下避免细胞受到损伤，并参与细胞的增殖分化、诱导细胞凋亡。近年的研究发现HSP广泛的参与了肿瘤细胞的细胞周期调控、增殖及凋亡、分化，并与肿瘤免疫、多药耐药等有密切关系。在多种肿瘤中HSP27高表达与肿瘤预后有关，但在不同的肿瘤中生物学功能及临床意义不同。GRP94是分子量为94的葡萄糖调节蛋白(Glucoseregulated protein, GRPs),是HSP90家族的成员，作为分子伴侣之一，其主要功能是协助蛋白折叠、伸展、组装和表达，抑制错误折叠蛋白的分泌。GRP94与肿瘤细胞的分化和侵袭有关，还可以促使肿瘤细胞的增殖、转移、耐药性获得等，在肿瘤治疗及预后中具重要意义。巨噬细胞游走抑制因子MIF是在T淋巴细胞中发现的一种可溶性、多功能细胞因子，与免疫细胞的活化有关，具有抑制巨噬细胞移动的功能，还可促进肿瘤细胞的分离及移动，有利于肿瘤细胞的组织侵袭过程，且表达水平与患者的预后关系密切。CD（组织蛋白酶D）是一种天冬氨酸肽链内切酶，包括前体（Pro-cathepsin D, pCD，MW52kDa）、中间体（MW48kDa）以及成熟体（MW，34kDa）。CD的生理功能是在溶酶体的酸性环境中降解蛋白质，但在病理状态下，CD可降解细胞外基质及基底膜，促进恶性肿瘤的侵袭和迁移等生物学过程。近年的研究发现，CD的高表达与肿瘤早期复发相关，并提示预后不良。本研究首先应用免疫印迹(Western blot)技术验证了上述蛋白质分子CD、pCD、MIF、GRP94、 HSP27在ESCC及癌旁组织中的差异表达；然后应用免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）技术探讨了HSP27、GRP94、MIF在具有5年生存期随访资料ESCC蜡块组织标本中的表达规律和特征，进而分析HSP27、GRP94、MIF表达与ESCC临床病理资料的相关性及在预后中的作用，为食管癌的分子诊断及预后评估的分子标志物的筛选及鉴定提供实验证据。目的通过研究CD、pCD、MIF、GRP94、HSP27等多个肿瘤标志物在各TNM分期的ESCC组织的表达特征及规律，确定其与ESCC患者临床病理资料相关性，评价多个肿瘤标志物在ESCC术后风险预警作用；进一步明确食管鳞癌多阶段、多分子演进的分子机制，为建立高危人群筛查、早期诊断和预后评估的生物指标及手段奠定良好的工作基础。方法1. Western blot检测CD、pCD、MIF、GRP94、HSP27等蛋白质分子在ESCC及癌旁手术切除标本组织中的差异表达；2. IHC检测HSP27、GRP94和MIF在各TNM分期的ESCC组织的表达特征及规律，分析其与ESCC患者临床病理资料相关性及ESCC术后风险预警作用。结果1. Western blot验证了CD、pCD、MIF、GRP94在ESCC组织中表达明显升高，而HSP27的表达降低；2. ESCC组织中GRP94的高表达与分化程度呈正相关（P=0.002），MIF、GRP94的表达增高与淋巴结转移（P=0.047，P=0.016)、TNM分期(P=0.008，P=0.002)、ESCC患者术后5年生存期缩短(P=0.01，P=0.001)呈正相关；3. HSP27的表达与淋巴结转移(P=0.004)、TNM分期(P=0.008)、ESCC患者术后5年生存期缩短(P=0.007)呈负相关；4. Cox多因素分析表明：MIF、GRP94是ESCC术后风险评估中独立因素（P=0.026，P=0.007)。结论1. CD、pCD、MIF、GRP94、HSP27可能是食管癌变多阶段演进过程中的重要变化分子；2. MIF、GRP94、HSP27的表达状态与ESCC的恶性生物学行为相关，是ESCC预后风险评估新的分子标志物。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
1 引言  13-17
2 材料、试剂与仪器  17-23
  2.1 Western blot 蛋白电泳材料及试剂  17-20
  2.2 免疫组化所需试剂、材料（对象）  20-21
    2.2.1 实验对象及处理  20
    2.2.2 试剂  20-21
  2.3 主要仪器  21-23
3 方法  23-29
  3.1 Western blot  23-27
    3.1.1 食管鳞癌及癌旁组织标本处理并提取蛋白  23
    3.1.2 BCA 法测定各组织总蛋白浓度  23-24
    3.1.3 蛋白质凝胶电泳  24-27
  3.2 免疫组化  27-29
4 结果  29-43
  4.1 Western blot 结果  29
  4.2 IHC 结果  29-31
    4.2.1 GRP94 在食管鳞癌中的表达特征  30
    4.2.2 MIF 在食管鳞癌中的表达特征  30
    4.2.3 HSP27 在食管鳞癌中的表达特征  30-31
  4.3 Cox 模型多因素分析  31-43
5 讨论  43-49
结论  49-51
参考文献  51-55
文献综述组织蛋白酶 D 与恶性肿瘤的侵袭、转移及预后关系的研究进展  55-67
  1. cath-D 的生物学特点  55-57
    1.1 分子结构与理化性质  55
    1.2 合成、转运和定位  55-56
    1.3 cath-D 的生物学作用  56-57
  2. cath-D 的检测方法  57-58
    2.1 定性的检测方法  57-58
    2.2 定量的检测方法  58
  3. cath-D 在恶性肿瘤中表达的机制  58
  4. cath-D 和肿瘤的分期及分级的相互关系  58-59
  5. cath-D 表达与各种恶性肿瘤的关系  59-61
    5.1 cath-D 与乳腺癌  59
    5.2 cath-D 与宫颈癌  59
    5.3 cath-D 与消化道肿瘤  59-60
    5.4 cath-D 与肺癌  60-61
  6. cath-D 的其它相关因素  61-62
    6.1 cath-D 与 ER、PR 的关系  61
    6.2 cath-D 与 cath-B 和 cath-L 对恶性肿瘤的影响  61-62
    6.3 cath-D 与 P53 的关系  62
    6.4 cath-D 与 VEGF、c-erbB-2 及 CD15 等因子对肿瘤的影响  62
  7. cath-D 在恶性肿瘤中的研究展望  62-63
  参考文献  63-67
附录  67-69
致谢  69-71
在读期间发表的学术论文及研究成果  71-72

食管鳞癌中多肿瘤标记物表达的临床意义

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