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Caspase-3蛋白在重离子辐照肺癌细胞中的功能研究

作　者: 徐华
导　师: 王子仁
学　校: 兰州大学
专　业: 动物学
关键词: 重离子人肺癌细胞H1299 Caspase-3 Caspase-9 Bcl-2/Bax 细胞凋亡
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

原发性肺癌是死亡率较高的恶性肿瘤之一,且发病率、死亡率有逐年升高趋势。放疗已成其治疗的主要手段,约85%的肺癌患者需要接受放射治疗。研究表明,电离辐照可通过多种信号传导途径诱导细胞凋亡,达到治疗目的。Caspase-3是Caspase家族中最重要的蛋白酶,是多种凋亡途径的共同下游效应部分,是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。本实验通过研究12C6+射线辐照人肺癌细胞株H1299,观察12C6+于不同剂量、不同时间辐照细胞周期和细胞凋亡的动态变化及检测Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白等的表达,探讨重离子辐照治疗肺癌的理论依据。实验结果如下：1重离子辐照可抑制H1299细胞的增殖流式细胞仪检测了细胞周期的分布情况：随着12C6+辐照剂量的加大,以G2/M期细胞阻滞为主,阻滞程度增加呈剂量依赖性,当12C6+辐照剂量超过6GyE时,G]前期细胞明显增加,出现细胞死亡。重离子束辐照能够有效地抑制肿瘤细胞复制,并促使肿瘤细胞死亡。采用噻唑蓝比色法观察重离子束辐照H1299细胞生长的增殖能力,结果显示随着重离子束剂量增加及培养时间的延长其细胞增殖率逐渐下降,其生长抑制曲线呈剂量-时间相关性。2重离子辐照对H1299细胞凋亡的影响荧光显微镜下观察细胞形态显示,经12C6+辐照后培养24h,可见多数细胞形态变的不规则,细胞核出现碎裂,核固缩及凋亡小体。随着辐照剂量增加,细胞凋亡率增加。流式细胞技术检测也显示了H1299细胞在重离子辐照下,随着剂量的增加细胞凋亡率也明显增加,揭示了重离子可体外诱导H1299细胞凋亡。3重离子辐照与相关凋亡基因的表达Caspase-3活性分析试剂盒检测显示,H1299细胞在重离子辐照后,Caspase-3蛋白酶活性随辐照剂量的增加而增加,揭示重离子辐照可提高Caspase-3蛋白酶活性,且与细胞凋亡率变化呈正相关。Western-blotting法和RT-PCR检测实验结果显示,Caspase-3的基因条带随着剂量加大逐渐加深,表明12C6+辐照可匕调Caspase-3表达,并呈一定剂量依赖；免疫组化检测结果显示了在重离子辐照下,随着辐照剂量的增加,Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达均有增加,而Bcl-2蛋白表达呈下降趋势,Bcl-2/Bax蛋白比值下降；表明重离子辐照可激活Caspase-3的活性。而Bax的表达上调在一定程度上抑制了Bcl-2蛋白的功能,Caspase-3、Caspase-9蛋白共同参与了细胞凋亡,提示重离子辐照诱导H1299细胞凋亡可能是通过Caspase-3途径调控的。4Caspase-3活性抑制实验：当H1299细胞经Caspase-3抑制剂预处理后,观察培养24h的各组细胞活性和细胞凋亡率显示：Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-fmk)能特异性阻断Caspase-3活性,同时降低细胞凋亡发生。本研究从以上实验中得到下列结论：重离子辐照能够体外抑制H1299细胞增殖。可能是通过激活肺癌细胞H1299内Caspase-3而诱导P53非依赖性细胞凋亡,Caspase-3蛋白表达与辐照敏感性成正比。Caspase-3、Caspase-9蛋白共同参与了细胞凋亡。因此,重离子可能是通过激活H1299细胞内Caspase-3蛋白酶活性并降低Bcl-2/Bax比值而诱导细胞凋亡,Caspase-3蛋白参与了调控肺癌细胞H1299的细胞周期,提示重离子辐照诱导H1299细胞凋亡可能是通过Caspase-3途径调控的。通过调控Caspase-3基因的表达可能改变肿瘤细胞的放射敏感性,这有望为提高肿瘤放射治疗提供新思路与新方法。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章前言  12-34
  1 重离子治疗肿瘤的优越性和前景  12-15
    1.1 重离子束辐照剂量的精确分布  13-14
    1.2 重离子束辐照氧效应  14
    1.3 重离子束辐照的生物学效应  14-15
    1.4 重离子束辐照细胞周期的影响  15
  2 重离子临床研究现状  15-17
  3 我国重离子医学研究现状  17-18
  4 CASPASE功能研究  18-32
    4.1 Caspase与肿瘤的关系  18
    4.2 Caspase与细胞凋亡的关系  18-21
    4.3 Caspase-3在肿瘤治疗中的作用  21-23
    4.4 Caspase-3与Bcl-2家族相互作用  23-25
    4.5 Caspase抑制剂的研究进展  25-26
    4.6 电离辐照与细胞凋亡  26-32
    4.7 辐照敏感性与凋亡机制  32
  5 选题的目的及意义  32-34
第二章材料与方法  34-42
  1 研究对象  34
    1.1 细胞株  34
    1.2 细胞的复苏与传代  34
  2 实验方法  34-42
    2.1 细胞辐照  34-35
    2.2 实验分组  35
    2.3 荧光显微镜下观察细胞形态学变化  35-36
    2.4 细胞周期的测定  36
    2.5 细胞增殖抑制实验  36
    2.6 流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡  36
    2.7 Caspase-3酶活性的测定  36-37
    2.8 Caspase-3活性抑制实验  37
    2.9 免疫组化法检测相关凋亡蛋白的表达  37-38
    2.10 Western Blotting法检测~(12)C~(6+)辐照后Caspase-3蛋白的表达  38-39
    2.11 RT-PCR检测Caspase-3 mRNA基因表达  39-42
第三章结果  42-56
  1 H1299细胞形态学改变  42-44
  2 ~(12)C~(6+)辐照对H1299细胞周期的影响  44-45
  3 ~(12)C~(6+)对H1299细胞增殖的影响  45-47
  4 流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡  47
  5 CASPASE-3酶活性影响  47-48
  6 CASPASE-3活性抑制实验  48-49
  7 免疫组化法检测相关凋亡蛋白的表达  49-53
    7.1 Caspase-3蛋白免疫组化检测结果  49-50
    7.2 Caspase-9蛋白免疫组化检测结果  50-51
    7.3 Bcl-2蛋白免疫组化检测结果  51-52
    7.4 Bax蛋白免疫组化检测结果  52-53
    7.5 ~(12)C~(6+)辐照H1299细胞24h后Bcl-2/Bax蛋白比值  53
  8 WESTERN BLOTTING检测CASPASE-3蛋白的表达  53-54
  9 RT-PCR检测CASPASE-3 MRNA表达水平  54-56
第四章讨论  56-68
  1 重离子诱导H1299细胞出现凋亡现象  57-59
  2 重离子抑制H1299细胞增值  59-60
  3 CASPASE-3参与了细胞调控通路  60-63
  4 BCL-2参与了CASPASE-3介导的细胞增值与凋亡调控  63-65
  5 非P53通道肿瘤细胞凋亡机制  65-68
第五章结论  68-69
参考文献  69-76
在读期间的科研成果  76-77
致谢  77

Caspase-3蛋白在重离子辐照肺癌细胞中的功能研究

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