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可溶性CD40L促进宫颈癌患者DC分化成熟及其相关机制研究

作　者: 焦煜茜
导　师: 单保恩; 艾军
学　校: 河北医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: sCD40L 树突状细胞（DC）免疫调节信号转导通路细胞因子
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：研究可溶性CD40配体(soluble CD40ligand，sCD40L)对宫颈癌患者DC分化、成熟及其免疫活性的影响，并探讨其作用机制，为sCD40L应用于临床宫颈癌综合治疗提供科学依据。方法：1采用密度梯度离心法分离出宫颈癌患者单个核细胞（MNC），用含10%FBS的RPMI1640培养基，培养2h后，去除非贴壁细胞，收集贴壁的细胞。将得到的贴壁细胞加入细胞因子GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（20ng/ml）进行DC的诱导培养，隔日半量换液并补加细胞因子，培养5d后，将细胞分为三组：对照组只加入GM-CSF和IL-4；TNF-α组加入TNF-α(10ng/ml)、GM-CSF和IL-4；sCD40L组加GM-CSF、IL-4及sCD40L（20ng/ml）。各组均培养至8d后收集细胞进行后续实验。2采用FCM检测各组DC表面CD80、CD86、CD83、CD1a、MHCI及MHCII的表达百分率。3采用RT-PCR技术半定量检测各组DC表达IFN-γ、IL-12、IL-10及TGF-β1mRNA的水平。并用ELISA技术检测各组培养体系中IFN-γ、IL-12、IL-10及TGF-β1的含量。4采用Western blot和RT-PCR技术分别从蛋白和基因水平检测sCD40L对树突状细胞信号通路蛋白MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3表达水平的影响。5采用MTT法通过混合淋巴细胞反应（MLR）检测不同组DC刺激异基因T细胞增殖能力。6采用ELISA技术分别检测各组MLR体系中IFN-γ和IL-4的含量。7采用MTT法检测各组DC诱导负载冻融抗原细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对Hela细胞株的杀伤活性。结果：1在诱导宫颈癌患者MNC分化为DC的过程中，不同组的DC均发生了形态学变化。sCD40L及TNF-α诱导组DC不仅细胞数量较对照组细胞数明显增多，且成簇分布，增大的胞体表面伪足状突起更为明显。2sCD40L诱导组DC表达CD80、CD86、MHCI、MHCII及CD1a的水平明显高于对照组DC（P<0.05）。与TNF-α诱导组相比，无明显差异（P>0.05）。而sCD40L诱导组和TNF-α诱导组DC表达CD83的水平明显高于对照组DC（P<0.01）。同时，sCD40L诱导组DC表达CD83的水平明显高于TNF-α诱导组。3RT-PCR结果显示， sCD40L诱导组DC表面表达IFN-γ和IL-12mRNA的水平明显高于对照组DC（P<0.01）；而表达IL-10及TGF-β1的水平则明显低于对照组DC（P<0.01）。4ELISA结果显示，sCD40L诱导组、TNF-α诱导组和对照组DC培养上清中细胞因子IFN-γ的分泌水平分别为322.15±72.10、267.79±45.33、185.65±56.22，细胞因子IL-12的分泌水平分别为133.60±22.17、119.43±15.46、65.89±12.71，细胞因子IL-10的分泌水平分别为97.81±13.45、101.87±16.35、129.67±23.11，细胞因子TGF-β1的分泌水平分别为44.67±7.86、42.24±9.98、96.33±14.57。其中sCD40L诱导组培养上清中IFN-γ和IL-12的含量明显高于TNF-α诱导组及对照组（P<0.01）；而IL-10及TGF-β1的含量与TNF-α诱导组无明显差异（P>0.05），但明显低于对照组DC(P<0.01)。5sCD40L组、TNF-α组、对照组DC表达MAPKp38蛋白水平分别是1.24±0.34、0.92±0.27、0.61±0.31。sCD40L组、TNF-α组、对照组DC表达P-STAT1蛋白水平分别是1.17±0.37、0.69±0.28、0.37±0.12。sCD40L组、TNF-α组、对照组DC表达P-STAT3蛋白水平分别是0.99±0.21、0.79±0.18、0.52±0.29。其中TNF-α组、sCD40L组DC中转录因子MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3蛋白及mRNA的水平均明显高于对照组（P<0.01），同时sCD40L组DC表达上述三类转录因子的水平明显高于TNF-α组（P<0.05），结果提示CD40L对DC分化成熟的作用，可能是通过激活MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3信号通路实现的。6MTT实验结果显示，当DC：T细胞为1：80时，sCD40L组DC刺激T细胞增殖的OD值明显高于对照组（P<0.01），但与TNF-α组无明显差异（P>0.05）。但当DC：T细胞分别为1：10和1：40时，sCD40L组DC刺激T细胞增殖的OD值不仅明显高于对照组（P<0.01），也明显高于TNF-α组（P<0.05）。7ELISA实验结果显示，sCD40L组及TNF-α组MLR体系中IFN-γ的含量明显高于对照组（P<0.01），同时sCD40L组MLR体系中IFN-γ的含量明显高于TNF-α组（P<0.05）；而sCD40L组及TNF-α组MLR体系中IL-4的含量则明显低于对照组（P<0.01），而sCD40L组及TNF-α组MLR体系中IL-4的含量，无明显差异（P>0.05）。8MTT法检测结果显示，当E：T分别为10：1及20：1时，CD40L组及TNF-α组CTL对Hela细胞的杀伤活性均明显高于对照（P<0.01），CD40L与TNF-α组相比，杀伤率虽有增高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。但当E；T为50：1时，sCD40L组及TNF-α组CTL对Hela细胞的杀伤活性均明显高于对照组（P<0.01），同时，sCD40L组CTL对Hela细胞的杀伤活性明显高于TNF-α组（P<0.05）。结论：1CD40L可促进DC成熟，并上调DC表面CD80、CD86、MHCI及MHCII、CD1a及CD83分子表达。2经CD40L刺激后，能够明显上调DC分泌IFN-γ、IL-12的水平，下调DC分泌IL-10、TGF-β1的水平。其机制可能与影响MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3信号转导通路有关。3sCD40L可明显提高DC诱导同种异体T淋巴细胞增殖的功能，促进DC诱导下，T细胞分泌IFN-γ，抑制其分泌IL-4。4经sCD40L刺激后的冻融抗原致敏DC可明显促进CTL对宫颈癌Hela的杀伤作用。

可溶性CD40L促进宫颈癌患者DC分化成熟及其相关机制研究

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