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背景和目的支气管哮喘(简称哮喘)是一种以气道反应性增高,可逆性气流受阻,黏膜高分泌和血清高IgE为特点的气道慢性炎症性疾病。其实质是以气道嗜酸性粒细胞、Th2细胞和肥大细胞浸润为主,其特征是Th1/Th2细胞免疫失衡以及Th2细胞占优势,进而促进Th2细胞因子IL-4、IL-13等的产生,诱导以IgE依赖的超敏反应和嗜酸性炎症。近年来,我国哮喘的发病率、住院率及死亡率逐年增加,严重威胁人们特别是儿童的身体健康。据调查,在我国哮喘患者至少达2000万以上,哮喘的患病率约为1%,其中儿童高达3%。Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)是一种新发现的细胞跨膜转导受体,能识别自然界中微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),能调节机体的先天性和获得性免疫反应。TLRs对Th1/Th2免疫平衡和调节性T细胞的功能起着重要调节作用,在哮喘的发展机制中发挥重要功能。CD4+T细胞是过敏反应性气道炎症的主要效应细胞,分为Th1型和Th2型两大类。Th1细胞主要分泌IFN-r, IL-12等因子,而Th2细胞主要分泌IL-4, IL-13等因子。IL-12是刺激Th0细胞向Th1细胞分化的最有力的细胞因子,能调节Th1/Th2免疫反应,刺激Th1型细胞因子尤其是IFN-r的分泌,抑制Th2细胞的功能和IgE的产生,诱导肺内嗜酸性粒细胞的凋亡,降低气道高反应性。IL-13是一种主要由Th2细胞分泌的多效性细胞因子,调节Thl和Th2细胞反应类型,促使嗜酸性粒细胞的募集并减少其凋亡,促进IgE分泌,在哮喘等过敏性疾病中发挥重要作用。有研究表明小儿哮喘的发病机制与T淋巴细胞及其分泌的细胞因子息息相关,Th1细胞和Th2细胞在数目、活化程度、功能方面的比例失衡是造成哮喘气道变应性炎症的主要因素。Th1型细胞数目减少或功能低下即产生IL-12不足,而Th2型细胞数目增多或功能高进即IL-13分泌增加,将促使B细胞合成IgE的作用增强。IL-12、IL-13及IgE等细胞因子在哮喘发病机理和免疫调节中越来越重要。咪喹莫特类药物是一种新型的小分子免疫调节剂,它能启动机体的免疫反应系统,促进Th1类细胞因子和IgG2的产生并抑制Th2类细胞因子和IgE的产生[5]。TLR7是Toll样受体家族中的重要成员之一,有研究表明TLR7能特异性识别咪喹莫特,能诱导Th1细胞因子的分泌,抑制Th2细胞因子的产生,从而减轻气道炎症,维持机体的免疫平衡,但其作用机制尚不十分明确。由于目前国内关于TLR7及其配体咪喹莫特治疗哮喘免疫机制的研究不多,故本课题通过RT-PCR法测定哮喘小鼠模型中肺组织TLR7mRNA的表达水平,ELISA法测定肺泡灌洗液(BALF)中IL-12、IL-13及血清中OVA-IgE的浓度,来探讨咪喹莫特治疗哮喘的主要免疫机制,为进一步治疗哮喘提供新的研究方法。材料和方法1实验动物和分组鼠龄为4周的雌性BALB/C纯系小鼠30只,SPF级,体重为15-20g,随机分为正常组,哮喘组,咪喹莫特组,每组各10只。2模型制备哮喘组：在第1天、第7天、第14天分别予小鼠腹腔注射OVA致敏液(含OVA100ug和氢氧化铝凝胶400ug)0.1ml,21天后以10%OVA溶液超声雾化激发30min,持续7天。咪喹莫特组：在哮喘组的基础上,在雾化吸入10%OVA溶液前1h预先吸入0.15%咪喹莫特混悬液30min,连续7天。正常组：用等量的生理盐水代替OVA致敏液雾化激发小鼠,方法同哮喘组。3实验测定取各组小鼠左上叶肺组织,4%中性多聚甲醛固定,进行石蜡切片、HE染色,收集支气管肺泡灌洗液,进行肺泡灌洗液(BALF)细胞分离、计数及IL-12、IL-13水平的检测；采取眼球血进行血清IgE的水平的测定；取出右上叶肺组织进行TLR7mRNA表达水平的检测。4统计学分析使用SPSS11.5统计软件对各组数据进行统计学分析,用均数±标准差(x±s)的形式来表示,3组小鼠间的数据比较采用单因素方差分析,数据间的两两比较用LSD-t检验,P<0.05表明差异有统计学意义。结果1病理结果光镜下,正常组小鼠支气管管壁无增厚,无异常的分泌物,气管粘膜下及肺泡腔内无炎性渗出物及炎症细胞渗出。哮喘组小鼠细支气管的管壁平滑肌增生增厚,支气管分泌物增加,纤毛上皮细胞脱落,排列紊乱,周围组织水肿,微血管通透性增加,血管和支气管周围组织见较多炎性细胞浸润,以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主。与哮喘组相比,咪喹莫特组小鼠的炎性细胞及炎性渗出物等均有所减少。2肺泡灌洗液中细胞计数与分类在肺泡灌洗液中,哮喘组小鼠的细胞总数及嗜酸性粒细胞、淋巴细胞与正常组比较明显增加,而咪喹莫特治疗组小鼠较哮喘组有所减轻(P<0.05)。3各组小鼠肺泡灌洗液中IL-12、IL-13和血清中IgE水平在肺泡灌洗液中,哮喘组小鼠IL-12水平较正常组减少,咪喹莫特组IL-12高于哮喘组但低于正常组(P<0.05)；哮喘组小鼠中的IL-13水平较正常组升高,咪喹莫特组IL-13与哮喘组比较降低(P<0.05),但较正常组升高；哮喘组小鼠血清中的IgE水平较正常组显著升高,而咪喹莫特组中的IgE水平明显低于哮喘组,但高于正常组；IL-12与IgE呈负相关(r=-0.802),而IL-13与IgE呈正相关(r=0.774)。4各组小鼠肺TLR7mRNA基因的表达哮喘组小鼠肺组织TLR7mRNA基因的表达低于正常组,咪喹莫特组小鼠肺组织TLR7mRNA基因的表达明显高于哮喘组和正常组(P<0.05)。结论1雾化吸入咪喹莫特能上调Thl细胞因子IL-12水平且IL-12与血清IgE水平呈负相关,还能下调Th2细胞因子IL-13水平且IL-13与IgE水平呈正相关,使免疫反应偏向Th1型,从而减轻气道炎症反应与及高反应性；2雾化吸入咪喹莫特能上调TLR7mRNA的表达,在减轻哮喘炎症反应中起一定的免疫调节作用。
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