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462例肺结核患者结核分枝杆菌MLVA基因分型的研究

作　者: 李卓林
导　师: 于雅琴
学　校: 吉林大学
专　业: 流行病与卫生统计
关键词: 结核病结核分枝杆菌基因分型多位点可变数目串联重复序列分析 Hunter-Gaston指数
分类号: R521
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

肺结核已成为威胁人类健康的全球性疾病，在发展中国家仍然是一个重大的公共卫生负担。作为早期基因分型金标准的插入序列6110限制性片段长度多态性（IS6110‐RFLP）分型，其方法较为繁琐，结果不易分析，实验室间的结果很难进行比对。多位点数目可变串联重复序列基因分型（MLVA）技术简便快速，可操作性强，其速度远超其他分型方法，且适用于大规模菌株基因型鉴定。目的利用MLVA分型技术，探讨吉林省结核病院结核分枝杆菌的基因型，流行趋势以及分布情况，为吉林省结核病的防控工作提供理论依据。方法收集吉林省结核病院2011年-2012年肺结核患者痰液标本的结核分枝杆菌分离株，利用MLVA基因分型方法，对其进行基因分型的初步研究。本研究选用12个数目可变串联重复序列（VNTR）位点进行分型检测，采用Totalab软件对检测结果进行数据化分析，并利用BioNumerics（6.0）软件得出聚类分析结果。用SPSS（13.0）统计软件对462株结核分枝杆菌基因型不同因素的成簇性、186株优势菌株和与数据库比对所得北京家族基因型结果进行统计学分析。结果（1）462株结核分枝杆菌临床分离株的12个VNTR位点检测结果显示这些菌株均有明显的多态性，12个VNTR位点的Hunter-Gaston指数从0.296到0.756，其中分辨力较高的位点是MIRU26、MIRU31、MIRU10、MIRU40，中等分辨力的位点是MIRU16、MIRU4、MIRU39、MIRU27、MIRU23、MIRU24、MIRU2，分辨力较低的位点是MIRU20。（2）利用Ward法（树状图法）对462株临床分离株和1株标准菌株H37Rv，共463株菌株进行基因分型，分为4个基因群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），406个基因型，其中Ⅰ群占45％（210/463），含有210株菌和191个基因型，标准株也在该群，为主要流行菌型。（3）最近邻法对462株临床分离株和1株标准菌株H37Rv进行MLVA分型，结果分为6个基因群（a、b、c、d、e、f），460个基因型，a群占80％（371/463），为主要流行基因型，标准株在b群。（4）将462株临床分离株及标准株与数据库比对，结果显示北京家族基因型占70％（324/463），非北京家族基因型占30％（139/463）。非北京家族基因型主要包括Bov、CAS、H₃、H₄、T₁、T₃、LAM等基因型。（5）462菌株成簇基因型与非成簇基因型在性别（χ²=0.289，P=0.591）、年龄（χ²=0.909，P=0.340）、初治复治（χ²=3.135，P=0.077）、是否合并疾病（χ²=0.404，P=0.525）、临床类型（P>0.05）之间差异均无统计学意义。（6）462菌株优势菌株与非优势菌株在性别（χ²=2.803，P=0.094）、年龄（χ²=0.201，P=0.654）、初治复治（χ²=0.001，P=1.000）、临床类型（χ²=0.228，P=0.633）之间差异均无统计学意义，感染优势菌株基因型的患者中合并疾病的人数所占比例高于感染非优势菌株基因型患者中合并疾病人数所占比例（χ²=6.292，P=0.012）。（7）462菌株北京家族基因型与非北京家族基因型在年龄（χ²=0.490，P=0.484）、初治复治（χ²=0.304，P=0.582）、是否合并疾病（χ²=0.41，P=0.522）、临床类型之间（P>0.05）差异均无统计学意义，感染北京家族基因型患者中女性所占比例高于感染非北京家族基因型患者中女性所占比例（χ²=5.909，P=0.015）。结论研究结果初步显示（1）MIRU26、MIRU31、MIRU10、MIRU40位点是分析吉林省462例肺结核患者结核分枝杆菌基因分型的首选位点。（2）462株结核分枝杆菌临床分离株存在着明显的遗传多态性。MLVA基因分型至少分为四个基因群，主要流行菌型为Ⅰ群和a群。（3）吉林省462例肺结核患者来自不同县市其主要基因型群存在差异，大部分地区与总体的流行趋势相符。（4）吉林省462例肺结核患者是否感染成簇基因型与性别、年龄、初诊和复诊、是否合并疾病、临床类型均无关。（5）吉林省462例肺结核患者是否感染优势菌株基因型与性别、年龄、初诊和复诊、临床类型均无关，仅与是否合并其他疾病有关，感染优势菌株基因型患者合并其他疾病患者的比例高于感染非优势菌株基因型患者中合并其他疾病患者的比例。（6）吉林省462例肺结核患者是否感染北京家族基因型与年龄、初诊和复诊、是否合并疾病、临床类型均无关，与性别有关，感染北京家族基因型患者中女性所占比例高于感染非北京家族基因型患者中女性所占比例。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
英文缩略词表  11-12
第1章绪论  12-21
  1.1 结核病流行特征  12-15
    1.1.1 全球结核病流行现状  12-13
    1.1.2 我国结核病流行现状  13-14
    1.1.3 吉林省结核病流行现状  14-15
  1.2 结核病流行过程  15-16
    1.2.1 传染源  15
    1.2.2 传播途径  15
    1.2.3 易感人群  15-16
  1.3 结核病的诊断与治疗  16
  1.4 结核病的分子生物学研究  16-19
    1.4.1 结核分枝杆菌的生物学特征  16-17
    1.4.2 结核分枝杆菌的基因分型方法  17-19
  1.5 结核分枝杆菌 MLVA 基因分型研究  19-20
    1.5.1 可变数目串联重复序列  19
    1.5.2 多位点可变数目串联重复序列基因分型  19
    1.5.3 MLVA 分型法在结核分枝杆菌基因分型中的应用  19-20
  1.6 本课题研究意义  20-21
第2章材料与方法  21-29
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 实验对象  21
    2.1.2 实验菌株  21
    2.1.3 实验试剂  21
    2.1.4 实验耗材  21-22
    2.1.5 实验仪器  22
    2.1.6 实验试剂的配制  22
  2.2 研究方法  22-27
    2.2.1 调查内容  22
    2.2.2 结核菌的培养  22-23
    2.2.3 DNA 的制备  23
    2.2.4 结核菌的鉴定  23-25
    2.2.5 MLVA 分型检测  25-27
  2.3 数据整理与分析  27-29
    2.3.1 重复拷贝数的计算  27
    2.3.2 Hunter‐Gaston 指数（HGI）的计算  27
    2.3.3 聚类分析  27-28
    2.3.4 人群分布特征分析  28-29
第3章结果  29-52
  3.1 病例的一般状况  29
  3.2 分离菌株的鉴定  29-31
  3.3 VNTR 位点检测  31-38
    3.3.1 样本的重复性检测  31
    3.3.2 VNTR 位点检测结果  31-37
    3.3.3 不同位点的分辨力  37-38
  3.4 菌株的 MLVA 基因分型  38-46
    3.4.1 待测菌株 VNTR 位点的重复拷贝数  38
    3.4.2 Ward 法 MLVA 基因分型  38-42
    3.4.3 最近邻法 MLVA 基因分型  42-44
    3.4.4 MLVA 基因分型与数据库比对结果  44-46
  3.5 基因型成簇性的分布特征  46-48
    3.5.1 性别分布  46
    3.5.2 年龄分布  46
    3.5.3 临床特征分布  46-48
  3.6 优势菌株基因型的分布特征  48-50
    3.6.1 性别分布  48
    3.6.2 年龄分布  48
    3.6.3 优势菌株基因型的临床特征分布  48-50
  3.7 Spoligotyping 基因分型的分布特征  50-52
    3.7.1 性别分布  50
    3.7.2 年龄分布  50
    3.7.3 北京家族基因型的临床特征分布  50-52
第4章讨论  52-58
  4.1 12 个 VNTR 位点的多态性  52-53
  4.2 MLVA 基因分型研究  53-55
    4.2.1 Ward 法（树状图法）MLVA 基因分型研究  53-54
    4.2.2 最近邻法 MLVA 基因分型研究  54-55
  4.3 基因型成簇性分析  55
  4.4 优势菌株基因型分析  55-56
  4.5 Spoligotyping 基因分型分析  56-58
第5章结论  58-59
参考文献  59-66
攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果  66-67
课题资助情况  67-68
致谢  68

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