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肾综合征出血热病毒荧光抗体中和试验的建立及应用

作　者: 吴敏
导　师: 李琦
学　校: 河北医科大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 肾综合征出血热 汉坦病毒 健康人群 血清中和抗体 荧光抗体病毒中和试验 免疫水平
分类号: R512.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：本研究旨在建立一种检测人血清中肾综合征出血热病毒血清中和抗体的实验室方法，即荧光抗体病毒中和试验（FluorescentAntibody Virus Neutralization, FAVN），并将该方法应用于河北省健康人群血清中肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS）病毒中和抗体的检测及HFRS双价灭活疫苗免疫水平评价，以了解河北省健康人群血清中HFRS病毒中和抗体的水平及HFRS双价灭活疫苗应用后的免疫效果，进而指导HFRS的预防控制。方法：1细胞培养：使用Vero-E6细胞，按1:3分传，使其长成单层，然后取已长成单层的Vero-E6细胞，胰酶-EDTA溶液充分消化后，以配好的细胞生长液悬浮，加100μl至96孔细胞培养板的各孔内，放置于37℃，5%CO2细胞培养箱内培养，直至细胞长成单层。2病毒液的稀释：先测定实验用病毒株的TCID50，然后将病毒液稀释至100TCID50/100μl备用。3血清标本的稀释：将实验室保存的HFRS双价灭活疫苗接种前后的血清标本作为待检血清，将待检血清（允许检测前以一定比例稀释）做2倍稀释直至1:64。4中和过程：将稀释好的血清标本与等量病毒液混合，并将混合液置于37℃，5%CO2细胞培养箱内孵育1h。5将混合液接种细胞：取Vero-E6细胞已生长成单层的96孔细胞培养板，倒掉原有的细胞生长液，于对照及各检测孔内加入100μl的血清病毒混合液，置于37℃，5%CO2细胞培养箱内培养。6荧光单克隆抗体染色及显微镜下观察：用80%的丙酮固定后，加入稀释至工作浓度的荧光标记抗HV单克隆抗体，吹干后在显微镜下对感染细胞进行观察并记录结果。7检测FAVN法的敏感性、特异性及稳定性：分别采用FAVN法和空斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Tests，PRNT）法检测60份HFRS双价灭活疫苗免疫前后人血清（其中免疫前血清30份，免疫后血清30份）的中和抗体，通过比较两种方法所得结果对FAVN法的敏感性、特异性及稳定性进行检测。8FAVN法的应用：根据河北省HFRS的疫情情况，选择3个HFRS高发县为疫苗接种点，在每个接种点选择16～60岁既往无HFRS患病史的健康人群，分4个年龄组，进行分层随机抽样，每组抽取20人，共抽取观察对象240人。采集观察对象疫苗接种前后的血清标本，使用FAVN法检测血清标本中HFRS病毒中和抗体。结果：1接种病毒的细胞浓度的选择，通过使用不同的细胞浓度进行试验，只有当细胞浓度为4×104～4.5×104／孔时，在显微镜下观察才能看到分布均匀整齐的细胞，并且各细胞之间的界线清晰，所以只有这一区间浓度的细胞在用荧光抗体染色后才可在显微镜下观测到具有代表性的特异性荧光颗粒。本实验使用这一区间浓度的细胞来接种病毒。2血清病毒混合液中和作用时的环境条件比较，把血清病毒混合液放在37℃，5%CO2细胞培养箱内中和1小时与在4℃冰箱内中和过夜相比较，结果发现在4℃冰箱内中和过夜的混合液接种细胞后形成的荧光颗粒多于37℃条件下中和的混合液。因此本实验血清病毒液中和作用在37℃，5%CO2细胞培养箱内进行。3FAVN法的敏感性较好。分别采用FAVN法及PRNT法对60份HFRS双价灭活疫苗免疫前后人血清（其中免疫前血清30份，免疫后血清30份）的中和抗体进行检测，疫苗免疫后的血清用FAVN法测定的中和抗体阳性率为83.33%，用PRNT法测得的中和抗体阳性率为60%，二者存在显著性的差异（χ2=4.02，P<0.05），表明FAVN法与PRNT法相比敏感性较好。4FAVN法的特异性和稳定性较好。用FAVN法对30份HFRS双价灭活疫苗免疫前的人血清的中和抗体进行检测，结果全部都是阴性，和PRNT法检测结果相同，表明FAVN法具有较好的特异性。不同时间内重复使用FAVN法对25份已检测为阳性的血清标本进行3次检测，经方差分析，3次的检测结果差异没有统计学意义（F=3.08，P>0.05），表明FAVN法较稳定。5FAVN法检测对240名观察对象HFRS双价灭活疫苗免疫前和免疫后血清的中和抗体，疫苗免疫前的240份血清中有7份血清为中和抗体阳性，滴度在10～20之间，疫苗免疫前人群血清中的中和抗体阳性率（隐性感染率）为2.92%，中和抗体阳性的7人中，有6人为农民；疫苗免疫后的血清中和抗体明显升高，在免疫后的240份血清中，有169份中和抗体为阳性，中和抗体阳性率为70.42%，经卡方检验，免疫前后中和抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=2.35，P<0.05）。从年龄构成看，免疫后中和抗体阳性的对象中有104人年龄在26～45岁这一年龄段中，占中和抗体阳性总数的61.53%，提示中青年人接种疫苗后免疫效果可能更好些。结论：1建立了用于检测人血清中HFRS病毒中和抗体的荧光抗体病毒中和试验（FAVN）方法。2FAVN法的敏感性高于PRNT法，并且具有较好的特异性和稳定性。3河北省健康人群HFRS保护性抗体阳性率很低，人群对HFRS普遍易感。4HFRS双价灭活疫苗具有较好的免疫效果，人群接种后中和抗体阳性率在70%以上。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
英文缩写  11-12
前言  12-13
材料与方法  13-20
结果  20-23
附图  23-28
附表  28-32
讨论  32-33
结论  33-34
参考文献  34-38
综述 肾综合征出血热病毒抗体水平的血清学检测方法分析  38-47
  参考文献  44-47
致谢  47-48
个人简历  48

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性出血热
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