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CpG ODN作为重组乳酸乳球菌佐剂对小鼠免疫应答的影响

作　者: 王亚丽
导　师: 曾宪垠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: CpG ODN 重组乳酸乳球菌黏膜佐剂黏膜免疫鼻腔免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黏膜免疫作为机体的第一道屏障阻止经口腔、呼吸道、生殖道等途径感染的病原微生物入侵。乳酸乳球菌作为外源蛋白的传递系统,能将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面,继而同时诱导黏膜免疫和系统免疫。在本课题组制备的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vius, PRRSV) M蛋白的重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS基础上,配以佐剂以开发一种能诱导机体产生黏膜免疫反应和系统免疫反应的黏膜疫苗。胞嘧啶-鸟嘌呤寡聚核苷酸(CpG ODNs)是一种高效的免疫佐剂,既能增强抗原诱导的粘膜免疫应答,又能增强抗原诱导的系统免疫,即体液免疫和细胞免疫应答。本课题旨研究CPG ODN作为佐剂对重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS的免疫原性的影响。试验选取120只健康雌性BALB/c小白鼠(6-8周龄,体重22～25g)随机分为4组,每组30只。组Ⅰ鼻腔免疫PBS为空白对照组；组Ⅱ鼻腔免疫重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS菌株为重组菌组；组Ⅲ鼻腔免疫佐剂CpG ODN+重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS菌株为佐剂CpG ODN+重组菌组；组Ⅳ鼻腔免疫佐剂CpG ODN,为CpG ODN对照组。所有动物连续,即在第1d、2d、3d;11d、12d、13d;21d、22d、23d鼻腔免疫小鼠(免疫当天记为1d),免疫剂量为每只小鼠50ul悬浮菌液／天(细菌含量为1×1011CFU/mL),其中佐剂免疫剂量为每只小鼠为10ug/天。试验动物于第23d、30d、37d、44d、51d分别被处死,每次每组处死6只,取肠粘液、肺脏冲洗液、血液样品,以检测小鼠呼吸道和消化道黏膜s-IgA及血清特异性抗体IgG抗体,并在第37d时取脾脏以检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-y的含量。本研究所得结果如下：1、CpG ODN+重组菌组小鼠血清肠黏膜中的特异性s-IgA抗体含量显著高于重组菌组(P<0.01),重组菌组也显著高于佐剂组和空白对照组(P<0.01)。2、CpG ODN+重组菌组和重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量均显著高于佐剂组和空白对照组(P<0.01),CpG ODN+重组菌组和重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量尽管差异不显著,但CpG ODN+重组菌组小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量高于重组菌组。3、CpG ODN+重组菌组和重组菌组小鼠血清中IgG抗体含量均显著高于空白对照组和佐剂组(P<0.01)。CpG ODN+重组菌组小鼠血清中特异性IgG抗体含量比重组菌组高,CpG ODN+重组菌组小鼠血清中IgG抗体含量在23d、30d、37d、44d、51d内-直呈上升趋势,重组菌组小鼠血清中特异性IgG抗体在第30d达到最高水平,以后保持稳定状态；4.CpG ODN+重组菌组小鼠脾脏细胞悬液中IL-2、IL-5和IFN-γ含量高于重组菌组,显著高于佐剂组和对照组(P<0.01);CpG ODN+重组菌组IL-4含量高于重组菌组、佐剂组和空白对照组,每组间无显著差异(p>0.05)。结果表明,重组乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900-M/PRRS通过鼻腔免疫后能够诱导小鼠产生良好的黏膜免疫反应和系统免疫反应。CpG ODN作为重组乳酸菌佐剂免疫小鼠后,提高了小鼠黏膜s-IgA和血清中IgG抗体含量,增强了Thl型细胞免疫反应,为研究安全高效的重组菌黏膜疫苗奠定了理论基础。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
1 文献综述  10-24
  1.1 黏膜免疫佐剂及其种类  10-13
    1.1.1 Toll样受体  11
    1.1.2 ADP-核糖基化肠毒素  11-12
    1.1.3 黏膜免疫载体  12-13
    1.1.4 细胞因子  13
  1.2 CPG ODN  13-18
    1.2.1 CpG ODN结构及分类  14
    1.2.2 CpG ODN佐剂作用机理  14-15
    1.2.3 CpG ODN的应用  15-18
  1.3 黏膜免疫  18-21
    1.3.1 黏膜及黏膜免疫系统  18-19
    1.3.2 黏膜免疫疫苗  19-21
  1.4 猪繁殖与呼吸综合征  21-24
    1.4.1 猪繁殖与呼吸综合征免疫现状  22-24
2 试验的目的和意义  24-25
3 材料和方法  25-32
  3.1 材料  25-27
    3.1.1 表达菌株  25
    3.1.2 主要试剂(盒)  25-27
    3.1.3 试验仪器殴备  27
  3.2 试验方法  27-32
    3.2.1 PNZ8149/NZ3900-M/PRRS表达载体的诱导表达  27-28
    3.2.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析  28
      3.2.2.1 待测样品的处理  28
      3.2.2.2 SDS聚丙稀酰胺凝胶的配制及电泳  28
      3.2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶染色和脱色  28
    3.2.3 诱导表达后菌液细菌计数  28
    3.2.4 免疫用试验材料的制备  28-29
    3.2.5 试验动物分组及处理  29-30
    3.2.6 抗体采集及检测  30-31
    3.2.7 细胞因子(Cytokines)  31-32
4. 结果与分析  32-38
  4.1 重组菌的鉴定  32
  4.2 肠黏膜S-lgA含量  32-33
  4.3 呼吸道黏膜S-lgA含量  33-37
  4.4 血清IgG抗体含量  37
  4.5 小鼠脾细胞悬液细胞因子含量  37-38
    4.5.1 细胞免疫评价因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)含量  37
    4.5.2 黏膜淋巴因子(IL-5)含量  37-38
5 讨论  38-41
6 结论  41-43
参考文献  43-50
致谢  50-51
攻读学位期间发表的学术论文  51

CpG ODN作为重组乳酸乳球菌佐剂对小鼠免疫应答的影响

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