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柯萨奇病毒A16的分离及其灭活疫苗的免疫原性研究

作　者: 张文慧
导　师: 井申荣
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 手足口病 柯萨奇病毒A组16型 灭活疫苗 免疫原性 中和试验
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


手足口病(Hand foot and mouth disease, HFMD)是一种常见的传播途径复杂、传染性较强、在短时间内可造成大规模流行的病毒感染性疾病,柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16)是其主要病原体之一,感染率常常超过感染总人数的60%,至今还没有十分安全有效的疫苗和特效药来预防和治疗CA16感染。因此,研制出安全、有效的CA16疫苗对于手足口病的预防和控制至关重要。本课题从粪便中分离CA16,用现代化微载体技术制备CA16灭活疫苗,免疫小鼠,并对其免疫原性进行评价,为疫苗的研制提供了研究基础。本研究工作包括4个部分：(1)CA16的分离、鉴定；(2)CA16生物学特性研究；(3)微载体培养CA16并纯化；(4)CA16全病毒灭活疫苗的免疫原性检测。(1)CA16的分离、鉴定本研究选用Vero细胞从临床标本中分离肠道病毒,并用RT-PCR初步鉴定是否含有CA16,将从编号为DC1的标本中分离到的野毒株经过三轮蚀斑筛选后形成大小均一的空斑,挑取单克隆,并放大培养至第7代(DC1P7),经RT-PCR、测序、电镜观察、免疫荧光等证明DC1P7为CA16,同时对本次分离的CA16VP1区进行系统进化分析,判定该CA16毒株属于B2a亚型。(2)CA16生物学特性研究为了后期规模化培养CA16并纯化,首先对与此相关的CA16生物学特性进行研究,结果发现：①培养基中小牛血清浓度和pH对病毒的增殖有重要影响：选用GlBCO公司的DMEM培养基,无血清培养96h后CA16几乎不病变或病变异常,血清浓度0.5%-2.5%时似乎随着血清浓度的增加病变率增加；②培养基中NaHCO3浓度为0.165%左右时CA16增殖最快；③PEG沉淀和氯仿抽提对病毒滴度损失较大,且纯化效果不佳,不能用于后期抗原的纯化。④CA16在增殖过程中一部分释放到培养液上清,但主要存在于细胞内；⑤CA16对高温敏感,-20℃以下可长期保存。(3)微载体规模化培养CA16并纯化本实验中使用浓度为3g/L微载体培养Vero细胞和制备大量CA16, Vero细胞在微载体上培养5～7天长成单层,接种适量CA16病毒液至微载体上单层Vero细胞,72h后CPE达80%以上,收毒,感染滴度约3.56×1010TCID50/ml,经蔗糖密度梯度离心纯化后出现清晰灰白条带,在电镜下检测发现45%-60%蔗糖区间带和45%蔗糖带中有较多CA16病毒颗粒,且较纯。(4)CA16全病毒灭活疫苗的免疫原性检测将经蔗糖密度梯度离心初步纯化的CA16抗原吸出、透析除去蔗糖并浓缩,用β-丙内酯灭活后与A1(OH)3佐剂一起免疫动物,以免疫剂量8.6×104TCID50/只,分0,2,4周免疫三次,结果显示：本实验制备的CA16全病毒灭活疫苗具有较好的免疫原性,血清IgG抗体和中和抗体效价峰值分别达1:512、1:128,GMT分别为1：161.27、1：73.52。本论文成功地应用Vero细胞分离出CA16,并对其相关生物学特性进行研究,采用微载体培养技术制备的CA16全病毒灭活疫苗具有较好的免疫原性,为疫苗的研制提供了研究基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
插图和附表清单  10-12
缩略语索引  12-13
第一章 绪论  13-22
  1.1 手足口病  13-14
  1.2 手足口病的病原学特征  14
  1.3 柯萨奇病毒A组16型  14-20
    1.3.1 CA16感染的临床症状  14-15
    1.3.2 CA16的流行状况  15-16
    1.3.3 CA16基因组结构特征  16
    1.3.4 CA16的基因分型  16-17
    1.3.5 CA16的药物治疗及存在的问题  17-18
    1.3.6 CA16预防疫苗研究进展及存在的问题  18-20
    1.3.7 小结  20
  1.4 本论文研究目的及意义  20-22
第二章 柯萨奇病毒A组16型的分离及鉴定  22-58
  2.1 材料和方法  22-37
    2.1.1 材料  22-31
    2.1.2 方法  31-37
  2.2 结果  37-55
    2.2.1 病毒的分离和传代  37-38
    2.2.2 RT-PCR初步鉴定病毒  38-39
    2.2.3 三轮蚀斑筛选CA16单克隆  39-40
    2.2.4 CA16单克隆的鉴定  40-55
    2.2.5 CA16 VP1区系统进化分析  55
  2.3 讨论  55-57
    2.3.1 粪便中CA16的分离与鉴定  55
    2.3.2 CA16的蚀斑形成  55-56
    2.3.3 CA16的进化与流行  56-57
    2.3.4 CA16全基因序列测定与分析  57
  2.4 小结  57-58
第三章 柯萨奇病毒A组16型的生物学特性  58-69
  3.1 材料和方法  58-61
    3.1.1 材料  58
    3.1.2 方法  58-61
  3.2 结果  61-66
    3.2.1 牛血清浓度对CA16增殖的影响  61-63
    3.2.2 培养基中NaHCO_3浓度对CA16增殖的影响  63
    3.2.3 CA16的分布形式  63-64
    3.2.4 CA16 MOI的测定  64
    3.2.5 CA16的温度稳定性  64
    3.2.6 CA16的传代稳定性  64-65
    3.2.7 氯仿抽提对病毒滴度的影响  65-66
    3.2.8 PEG沉淀对CA16滴度的影响  66
  3.3 讨论  66-68
    3.3.1 CA16病毒增殖的影响因素  66-67
    3.3.2 病毒的浓缩  67
    3.3.3 抗原的初步纯化  67
    3.3.4 CA16的感染复数  67
    3.3.5 CA16的温度稳定性  67
    3.3.6 CA16的传代稳定性  67-68
    3.3.7 CA16的分布形式  68
  3.4 小结  68-69
第四章 CA16灭活疫苗的免疫原性检测  69-88
  4.1 材料和方法  69-78
    4.1.1 材料  69-72
    4.1.2 方法  72-78
  4.2 结果  78-85
    4.2.1 微载体大规模培养CA16  78-80
    4.2.2 超滤膜包浓缩后病毒的损失检测  80
    4.2.3 蔗糖密度梯度离心纯化病毒  80-81
    4.2.4 电镜检测病毒纯化效果  81-83
    4.2.5 病毒灭活及其灭活效果检测  83
    4.2.6 Al(OH)_3佐剂的制备及其对病毒的吸附效果检测  83
    4.2.7 ELISA检测血清IgG抗体效价  83-84
    4.2.8 中和试验  84-85
  4.3 讨论  85-87
    4.3.1 CA16的微载体培养  85
    4.3.2 CA16的浓缩  85
    4.3.3 影响CA16纯化效果的因素  85
    4.3.4 CA16的灭活  85-86
    4.3.5 抗原纯度和剂量对免疫原性的影响  86
    4.3.6 佐剂对免疫原性的影响  86-87
  4.4 小结  87-88
第五章 全文总结  88-89
第六章 展望  89-90
致谢  90-91
参考文献  91-96
附录A 攻读硕士期间发表论文及参与项目目录  96-97
附录B DC1与国内外CA16毒株VP1区核苷酸比对结果  97

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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