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腺病毒介导的hsp70对大鼠肝细胞氧化应激的保护作用

作　者: 臧琳
导　师: 杨焕民
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 基础兽医学
关键词: Hsp70 BRL-3A 氧化应激 腺病毒载体 冷应激
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


动物在冷应激过程中，肝脏因发生氧化应激而受损。Hsp70是一种能够提高机体应激耐受的蛋白，通过腺病毒载体感染可以将外源的hsp70引入细胞中并表达。基于此，本试验采用WST-1、原位染色、实时定量反转录PCR和western blotting等方法，针对腺病毒介导的hsp70对大鼠肝细胞氧化应激的保护作用及机制展开研究：（一）利用不同浓度H2O2作用BRL-3A细胞，根据细胞存活率筛选最佳的H2O2作用浓度和时间。然后以此浓度处理细胞，检测蛋白质羰基含量，SOD、GSH-Px和CAT酶活力，并与大鼠冷应激试验中肝脏氧化损伤指标相对比，探讨建立动物冷应激过程中肝脏氧化应激损伤的细胞模型的可行性。（二）以带有标签基因的腺病毒感染BRL-3A细胞，根据感染效率初筛病毒感染的最适浓度和作用时间。然后用带有目的基因hsp70的腺病毒以初筛出的最适浓度和时间感染BRL-3A细胞，并检测hsp70的mRNA丰度，最终确定能使hsp70的mRNA丰度最高的感染浓度和作用时间。之后在蛋白水平上验证BRL-3A细胞Hsp70过表达模型是否建立成功。（三）将感染带有hsp70腺病毒的Hsp70过表达细胞、感染空载体腺病毒的细胞和未感染病毒的细胞每一组都分为应激组和无应激组，给予相应的处理后，检测各组细胞的增殖情况，SOD、CAT和GSH-Px酶活力，LDH漏出率，GSH、MDA和蛋白质羰基含量，hsp70mRNA丰度及Hsp70表达量。以此探究重组腺病毒介导的hsp70感染细胞的方法对大鼠肝细胞氧化应激的保护作用，并希望能为Hsp70在动物抗冷应激相关领域的研究奠定基础。研究结果如下：（一）与对照组相比，500μmol/L H2O2作用于BRL-3A细胞3h，可导致细胞存活率下降（P＜0.01），蛋白质羰基含量升高（P＜0.01），SOD（P＜0.05）、GSH-Px（P＜0.05）和CAT（P＜0.01）酶活力均降低。结果表明，500μmol/L H2O2作用于BRL-3A细胞可导致氧化应激的发生，其相关指标与大鼠冷暴露后肝脏受损指标改变趋势相符。（二）通过筛选，浓度为1×107PFU/mL的病毒Ad-CMV-hsp70按MOI=20感染BRL-3A细胞48h，比其他浓度和时间组的细胞形态保持良好，感染效率高，hsp70的mRNA丰度高（P＜0.01）。检测该组细胞和病毒Ad-CMV-Null处理的细胞以及无病毒处理的对照组细胞蛋白表达量，结果显示Ad-CMV-hsp70组细胞Hsp70表达量最高，与其他两组相比均差异极显著（P＜0.01）。（三）与无病毒/应激组细胞相比，Ad-CMV-hsp70/应激组的增殖率高（P＜0.01），LDH漏出率低（P＜0.01），CAT活力高（P＜0.01），GSH-Px活力低（P＜0.05），GSH含量高（P>0.05），SOD活力高（P>0.05），蛋白质羰基含量高（P＜0.01），hsp70mRNA丰度及Hsp70蛋白表达量均高（P＜0.01）。结论：（一）500μmol/L H2O2作用于BRL-3A细胞3h可导致氧化应激的发生，并基本模拟了大鼠冷应激过程中肝脏所受的氧化应激损伤程度。（二）以浓度为1×107PFU/mL的病毒Ad-CMV-hsp70按MOI=20感染BRL-3A细胞48h，能够建立过表达Hsp70的肝细胞模型。（三）腺病毒介导的hsp70对大鼠肝细胞氧化应激有一定的保护作用。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
符号说明  8-10
第一章 文献综述  10-23
  1.1 氧化应激  10-13
  1.2 冷应激  13-16
  1.3 Hsp70  16-19
  1.4 BRL-3A 细胞  19-21
  1.5 本研究的背景与主要内容  21-23
第二章 H_2O_2诱导 BRL-3A 细胞模拟大鼠肝脏氧化应激损伤  23-36
  2.1 试验材料  23-24
  2.2 试验方法  24-29
  2.3 结果  29-34
  2.4 讨论  34-35
  2.5 小结  35-36
第三章 Hsp70 过表达模型的建立  36-55
  3.1 试验材料  36-37
  3.2 试验方法  37-48
  3.3 结果  48-52
  3.4 讨论  52-54
  3.5 小结  54-55
第四章 腺病毒介导的 hsp70 表达对 BRL-3A 细胞氧化应激的影响  55-70
  4.1 试验材料  55
  4.2 试验方法  55-59
  4.3 结果  59-65
  4.4 讨论  65-69
  4.5 小结  69-70
第五章 全文总结  70-71
  5.1 结论  70
  5.2 创新点  70-71
参考文献  71-80
致谢  80-81
作者简介  81

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