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毛细管电泳技术快速筛选海洋药用生物中常见核苷类化合物的方法研究

作　者: 史倩
导　师: 王小如; 陈军辉
学　校: 国家海洋局第一海洋研究所
专　业: 海洋化学
关键词: 海洋药用生物 核苷类化合物 排重 毛细管区带电泳 胶束电动毛细管色谱法 毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


核苷类化合物包括碱基、核苷、核苷酸以及上述化合物的衍生物或类似物，是构成脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的基本组成，除此之外，生物体中还有不少游离的核苷类化合物。游离核苷类化合物不仅存在于陆源药用生物体中，也广泛存在于海洋药用生物中。目前，采用天然产物化学传统方法开展药用生物活性成分研究的过程中，经常面临对游离核苷类化合物重复提取、分离、纯化和表征等问题，其结果是不同海洋药用生物中发现相同的核苷类化合物，造成人力物力的大量消耗，并大大降低了发现新化合物的效率。因此，在海洋药用生物活性成分研究过程中，实现对常见核苷类化合物的快速排重势在必行。本论文采用不同模式毛细管电泳技术，包括：毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱（MEKC）和毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱联用（CE-ESI-TOF/MS）等，发展海洋药用生物中15种常见核苷类化合物（包括：腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷、肌苷、2’-脱氧鸟苷和虫草素）快速分离、筛选新方法，为该类化合物的快速发现和排重提供新方法。本文研究内容和结果如下所示：1.为了获得毛细管电泳技术同时分离多种核苷类化合物的最适缓冲液分离体系，使用未涂层石英毛细管，二极管阵列检测器（DAD），对两类缓冲盐——挥发性缓冲盐（醋酸钠、碳酸氢钠、乙酸铵和乙二胺（DEA））和不挥发性缓冲盐（四硼酸钠、磷酸氢二钠）分离体系分离15种常见核苷类化合物的不同适应性进行了考察。结果发现，在CZE模式下，四硼酸钠和磷酸氢二钠缓冲体系无法将15种核苷类化合物同时分离，较适用于分析含核苷类化合物数量较少的样品。挥发性缓冲盐中，DEA分离效果最好，在经过一系列优化后，能够使15种目标化合物达到基线分离，且得到的色谱峰峰型良好。在大量样品的分析筛选过程中，需要经常对其进行更换，以保证方法的重复性。MEKC模式下，除DEA外，其余5种缓冲盐体系加入SDS后色谱峰的分离度均明显提高。2.针对挥发性缓冲盐分离体系稳定性较差、不利于实际样品准确定性定量分析的难题，本研究选取稳定性良好的磷酸氢二钠缓冲体系，发展MEKC模式同步分离筛选海洋药用生物中15种常见核苷类化合物的新方法。首先通过对进样量、分离电压、pH值、SDS浓度等条件的系统优化，获得最佳分离条件，即为：以含有70mmol/L SDS的25mmol/L的磷酸氢二钠溶液为背景电解质溶液，分离电压25kV，进样时间3sec（50mbar），pH值8.7（无需调节），检测波长260nm。在最佳实验条件下得到的电泳图中，核苷类化合物分离度高，峰型尖锐、对称，并保持较快的分离速度。然后，进行了方法学考察，结果表明，仪器精密度RSD值在1.4%-7.6%之间，日内重复性在8.2%以内和日间重复性在1.2%-10.8%之间，回收率在80.2%-112.9%之间，样品在24h内保持稳定。此外，将本方法用于海洋药用生物实际样品（以黄海葵为例）中常见核苷类化合物的快速筛选，通过与标准品的对比，从中发现了12种核苷类化合物。说明该方法快速、稳定、可靠，适合海洋药用生物复杂基质中15种常见核苷类化合物的快速筛选。3.建立了毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱(CE-ESI-TOF/MS)快速筛选海洋药用生物中多种核苷类化合物的新方法。通过对毛细管电泳分离条件和质谱检测条件的系统优化，获得了最佳仪器条件；使用未涂层石英毛细管柱，以含有5%甲醇的30mmol/L乙酸铵溶液（氨水调pH9.9）作为运行缓冲液，50%甲醇水溶液（含有0.25%甲酸）为鞘液（3μL/min），电喷雾质谱正离子模式检测。在最佳仪器条件下，各核苷类化合物精确质量数测定偏差均小于百万分之四，说明通过精确分子量信息进行核苷类化合物快速鉴别结果可靠；15种常见核苷类化合物CE-ESI-TOF/MS分析回归方程的相关系数均优于0.9933，线性范围均超过了一个数量级，检出限在0.03–1.0μg/mL之间，峰面积日间重复性RSD值在9.38-24.34%之间，能满足实际样品筛选的需要。此外，本方法成功用于海马、海龙等海洋药用生物中核苷类化合物的筛选，表明本方法是海洋药用生物复杂体系中多种核苷类化合物快速同步分析筛选的有效方法。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略语注释  9-14
第一章 绪论  14-35
  1 海洋药用生物活性成分研究简况  14-17
    1.1 海洋药用生物的种类和生物活性  14-15
      1.1.1 海洋药用生物的种类  14
      1.1.2 海洋药用生物成分的生物活性  14-15
    1.2 海洋药用生物活性成分研究进展和存在的问题  15-16
      1.2.1 海洋药用生物活性成分研究进展  15-16
      1.2.2 海洋药用生物活性成分研究存在的问题  16
    1.3 海洋药用生物活性成分化学研究传统方法与现代研究手段  16-17
  2 海洋药用生物中核苷类化合物研究概述  17-24
    2.1 核苷类化合物的概述  17-20
      2.1.1 核苷类化合物的生物来源  19
      2.1.2 核苷类化合物的生物活性  19-20
    2.2 核苷类化合物现代分析筛选、检测技术  20-23
      2.2.1 薄层色谱技术  20
      2.2.2 气相色谱技术  20-21
      2.2.3 液相色谱及液质联用技术  21-22
      2.2.4 毛细管电泳及与质谱联用技术  22-23
        2.2.4.1 毛细管区带电泳  22
        2.2.4.2 胶束电动毛细管色谱  22-23
        2.2.4.3 毛细管电泳-质谱  23
    2.3 海洋药用生物活性成分筛选研究中对核苷类化合物进行快速排重势在必行  23-24
  3 本文的研究目的、内容及研究意义  24
    3.1 研究目的与内容  24
    3.2 科学意义  24
  参考文献  24-35
第二章 毛细管电泳不同缓冲液体系分离核苷类化合物的适应性  35-47
  1 实验部分  35-36
    1.1 仪器与试剂  35-36
    1.2 仪器条件  36
      1.2.1 区带毛细管电泳法条件  36
      1.2.2 胶束电动毛细管色谱法条件  36
    1.3 标准溶液的配制  36
  2 结果与讨论  36-44
    2.2 CZE 缓冲盐分离体系  37-42
      2.2.1 CZE 不挥发性缓冲盐分离体系  37
      2.2.2 CZE 挥发性缓冲盐分离体系  37-39
      2.2.3 DEA 缓冲液分离条件优化  39-42
        2.2.3.1 DEA 缓冲液 pH 条件优化  39-40
        2.2.3.2 DEA 缓冲液浓度条件优化  40
        2.2.3.3 缓冲液中有机改性剂的优化  40-41
        2.2.3.4 其他条件的优化  41-42
    2.3 MEKC 不同缓冲盐分离体系  42-44
      2.3.1 MEKC 模式下挥发性缓冲盐体系  43-44
      2.3.2 MEKC 模式下不挥发性缓冲盐体系  44
  3 结论  44-45
  参考文献  45-47
第三章 胶束电动毛细管色谱法快速筛选海洋药用生物中的15种常见核苷类化合物  47-63
  1 实验部分  48-49
    1.1 仪器与试剂  48
    1.2 仪器条件  48
    1.3 标准溶液的配制  48
    1.4 海洋生物黄海葵样品的处理  48-49
  2 结果与讨论  49-61
    2.1 背景电解液（BGE）的选择  49
    2.2 MEKC 分离条件优化  49-53
      2.2.1 不同 SDS 浓度的优化  49-50
      2.2.2 不同缓冲液浓度的优化  50-52
      2.2.3 不同 pH 值条件的优化  52-53
      2.2.4 不同有机改性剂的优化  53
      2.2.5 仪器条件的优化  53
    2.3 核苷类化合物的快速筛选鉴别  53-56
    2.4 方法学考察  56-59
      2.4.1 标准曲线的绘制、检出限和定量限  56-57
      2.4.2 精密度  57
      2.4.3 重现性  57-58
      2.4.4 样品稳定性  58
      2.4.5 样品回收率  58-59
    2.5 海洋药用生物样品的分析  59-61
  3 本章小结  61
  参考文献  61-63
第四章 毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱联用技术快速筛选海洋药用生物中的常见核苷类化合物  63-82
  1 实验部分  63-65
    1.1 仪器与试剂  63-64
    1.2 仪器条件  64
      1.2.1 毛细管电泳分离条件  64
      1.2.2 电喷雾飞行时间质谱条件  64
    1.3 标准溶液的配制  64
    1.4 海洋药用生物样品的处理  64-65
  2 结果与讨论  65-80
    2.1 DEA 为缓冲盐对核苷化合物的质谱分析  65-66
    2.2 乙酸铵为缓冲盐对核苷化合物的质谱分析  66-71
      2.2.1 毛细管电泳分离条件的优化  66-70
      2.2.2 质谱条件的优化  70-71
        2.2.2.1 鞘液的组成和流速  70-71
        2.2.2.2 干燥气流速和温度、雾化气压力的优化  71
        2.2.2.3 毛细管电压、破碎电压和八级杆电压的优化  71
        2.2.2.4 微通道板电压和光电倍增管电压的优化  71
    2.3 核苷类化合物的快速筛选鉴别  71-77
    2.4 方法学考察  77-79
      2.4.1 标准曲线的绘制、检出限和定量限  77-78
      2.4.2 精密度  78
      2.4.3 重现性  78-79
      2.4.4 稳定性和回收率  79
    2.5 海洋生物中核苷类化合物含量的测定  79-80
  3 本章小结  80
  参考文献  80-82
第五章 结论  82-84
在学期间发表论文  84-87
致谢  87-88

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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