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利用黑麦草制乙醇菌种的筛选及分步糖化发酵工艺的研究

作　者: 吴馨娜
导　师: 杨再福
学　校: 东华大学
专　业: 环境科学
关键词: 黑麦草乙醇纤维素分步糖化发酵
分类号: TQ223.122
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着日益增长的能源消耗和严峻的环境问题,乙醇由于其廉价、清洁、可再生等优点有望替代石油成为新能源。目前世界上生产燃料乙醇的主要原料是谷物如玉米、小麦等,但对中国来说采用粮食作物生产燃料乙醇并不是可持续的方法。木质纤维素由于其廉价、可再生性、资源丰富等优点逐渐显现其做为燃料乙醇新型原料的优势。本文针对黑麦草(Lolium perenne)这一纤维原料,筛选可发酵其水解产物的菌株,应用分步糖化水解方法进行乙醇发酵,重点研究了分步糖化水解中的预处理及发酵工艺优化,为之后进一步研究提供基础。主要研究内容为：(1)实验以木糖为筛选因子,筛选出可利用黑麦草水解产物的菌株NS2,研究各项环境因子对菌株生长的影响,经过18SrRNA鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。(2)对黑麦草材料进行成分分析,考察其作为发酵材料的可行性：水份11.37%、挥发份73.38%、灰分4.78%、还原糖16.67%、总糖含量34.27%、木质素和粗纤维分别为6.33%和6.68%。(3)稀盐酸处理黑麦草粉各因素的研究,盐酸浓度1.0%(v/v)、水解温度120℃、水解时间120min、固液比为10%时水解率达到最高；运用正交实验分析盐酸较低温度预处理方式,当盐酸浓度为15%(v/v)、水解温度60℃、时间为100min、固液比为5%时预处理效果最佳。(4)研究不同的预处理剂对黑麦草的水解效果：1.0% (v/v)盐酸可使黑麦草的水解率达到最高48.36%；50%(v/v)硫酸使黑麦草的水解率达到31.64%；而用质量浓度为8%的NaOH和10%(v/v)的氨水水解黑麦草得到的发酵液中还原糖浓度分别可达16.11%和14.58%。(5)采用分步糖化水解发酵工艺(Separate Hydrolysis and Fermentation,SHF)发酵黑麦草产乙醇,最佳初始条件为温度38℃初始pH 4.5、菌种接种量10%、转速150r/min。(6)运用响应面分析法(Response Surface Methodology,RSM)分析了分步糖化水解工艺中菌种接种量(X1)、发酵时间(X2)、固液比(X3)对乙醇产率(Y1)的影响,并拟合二次数学模型：Y1=49.18+ 3.82 X1-1.47X2+8.64X3+5.57X1X2+5.31X1X3-0.32X2X3—10.14X12-5.77X22-10.07X32。结果表明,最佳的工艺参数为发酵菌种接种量10%,固液比10%,发酵时间60h。(7)研究不同的预处理对分步糖化发酵效果的影响：酸水解工艺中,盐酸处理方式的乙醇得率高于硫酸处理方式,为9.76%；碱处理方式中,氢氧化钠预处理方式明显优于氨水预处理方式,乙醇得率为10.01%；有机溶剂与酸碱联用处理方式的乙醇产量明显优于单独使用有机溶剂的乙醇产量。(8)研究分步糖化水解发酵工艺,拟合发酵过程中菌体生长、乙醇生成和还原糖消耗动力学模型。针对黑麦草残渣进行再利用的初步探讨。本研究受时间及实验条件限制,有待于进一步菌种改良诱变及发酵工艺优化的研究,将黑麦草做为原料应用于工业化生产燃料乙醇还需要进一步研究。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-14
第一章绪论  14-32
  1.1 生物质乙醇的研究进展  14-17
    1.1.1 生物质乙醇国外研究进展  14-16
    1.1.2 生物质乙醇国内研究进展  16-17
  1.2 生物质乙醇的原料及主要发酵菌种  17-25
    1.2.1 生物质产乙醇原料  17-18
    1.2.2 木质纤维素转化机理  18-19
    1.2.3 木质纤维素发酵菌种的研究  19-25
  1.3 纤维素发酵制乙醇预处理方法  25-27
    1.3.1 物理预处理法  25
    1.3.2 化学预处理法  25-26
    1.3.3 生物预处理法  26
    1.3.4 酶处理  26-27
  1.4 乙醇的发酵工艺及存在问题  27-29
    1.4.1 乙醇发酵工艺  27-28
    1.4.2 技术上存在主要问题  28-29
  1.5 课题研究概述  29-32
    1.5.1 课题研究目的及意义  29
    1.5.2 课题研究内容及步骤  29-32
第二章黑麦草发酵制乙醇菌种的研究  32-51
  2.1 实验材料  32-35
    2.1.1 实验菌种  32-33
    2.1.2 实验试剂  33-34
    2.1.3 实验仪器  34-35
    2.1.4 所需培养基及配制溶液汇总  35
  2.2 发酵菌种筛选及生理生化性质研究  35-40
    2.2.1 样品的采集  35-36
    2.2.2 菌种的筛选  36
    2.2.3 菌种生理生化性质研究  36-37
    2.2.4 结果与讨论  37-40
  2.3 菌株驯化  40-41
    2.3.1 菌种定向驯化  40
    2.3.2 结果与讨论  40-41
  2.4 环境因子对菌种生长影响的研究  41-47
    2.4.1 初始pH对菌株生长的影响  42
    2.4.2 乙醇含量对菌株生长的影响  42
    2.4.3 木糖浓度对菌株生长的影响  42
    2.4.4 NaCl浓度对菌株生长的影响  42
    2.4.5 温度对菌株生长的影响  42
    2.4.6 结果与讨论  42-47
  2.5 菌株的鉴定  47-50
    2.5.1 菌株的形态观察及生理生化性质  47
    2.5.2 菌株的基因鉴定  47-48
    2.5.3 结果与讨论  48-50
  2.4 本章小结  50-51
第三章黑麦草纤维预处理研究  51-70
  3.1 实验试剂及方法  51-54
    3.1.1 主要实验试剂  51-52
    3.1.2 实验仪器  52
    3.1.3 DNS(3,5-二硝基水杨酸)比色法测定还原糖  52-54
    3.1.4 扫描电镜分析(SEM)  54
    3.1.5黑麦草粉的制备  54
  3.2 黑麦草成份分析研究  54-56
    3.2.1 水份测定  54
    3.2.2 灰份测定  54
    3.2.3 挥发份测定  54
    3.2.4 粗纤维和木质素含量的测定  54-55
    3.2.5 总糖和还原糖含量测定  55
    3.2.6 结果与讨论  55-56
  3.3 不同的酸水解糖化黑麦草粉预处理研究  56-63
    3.3.1 稀盐酸高温水解黑麦草粉的研究  56-57
    3.3.2 盐酸较低温水解糖化研究  57-58
    3.3.3 浓硫酸水解糖化研究  58
    3.3.4 结果与讨论  58-63
  3.4 不同的碱糖化水解黑麦草粉研究  63-66
    3.4.1 NaOH溶液糖化水解黑麦草研究  63-64
    3.4.2 氨水糖化水解黑麦草研究  64
    3.4.3 结果与讨论  64-66
  3.5 有机-化学联合糖化水解黑麦草  66-67
    3.5.1 实验方法  66
    3.5.2 结果与讨论  66-67
  3.6 预处理后黑麦草粉的结构组织变化研究  67-68
    3.6.1 实验方法  67
    3.6.2 结果与讨论  67-68
  3.7 本章小结  68-70
第四章 SHF法发酵黑麦草纤维素工艺的优化  70-88
  4.1 实验材料及测定方法  70-73
    4.1.1 实验菌种  70
    4.1.2 实验试剂及仪器  70
    4.1.3 乙醇测定方法  70-72
    4.1.4 CO_2失重分析方法  72
    4.1.5 乙醇的发酵方法  72
    4.1.6 乙醇蒸馏方法  72-73
  4.2 不同条件对菌种发酵影响的研究  73-77
    4.2.1 温度对菌种发酵的研究  73
    4.2.2 初始pH对菌种发酵的研究  73
    4.2.3 接种量对菌种发酵影响的研究  73
    4.2.4 转速对菌种发酵影响的研究  73
    4.2.5 结果与讨论  73-77
  4.3 Box-Behnken设计法  77-81
    4.3.1 实验方法  77-78
    4.3.2 结果与讨论  78-81
  4.4 预处理方法对乙醇产率影响的研究  81-85
    4.4.1 不同预处理方式对乙醇产率的比较  81-82
    4.4.2 过滤水解液的发酵  82
    4.4.3 未过滤水解液的发酵  82
    4.4.4 结果与讨论  82-85
  4.5 混合菌种分步糖化发酵研究  85-86
    4.5.1 实验方法  85
    4.5.2 结论与讨论  85-86
  4.6 本章小结  86-88
第五章水解液脱毒分析及发酵过程模型建立  88-100
  5.1 实验材料及测定方法  88-89
    5.1.1 实验菌株  88
    5.1.2 实验试剂及仪器  88
    5.1.3 实验测定方法  88-89
    5.1.4 实验样品  89
  5.2 水解液脱毒分析  89-94
    5.2.1 活性碳吸附脱毒处理  89
    5.2.2 石灰中和脱毒处理分析  89-90
    5.2.3 脱毒后水解液组分分析  90
    5.2.4 结果与讨论  90-94
  5.3 黑麦草粉水解液脱毒后发酵生产乙醇  94-96
    5.3.1 脱毒前后水解液的发酵  94
    5.3.2 不同脱毒方式对发酵的影响  94
    5.3.3 结果与讨论  94-96
  5.4 发酵过程的动力学模型建立  96-99
    5.4.1 酵母细胞生长动力学模型的构建  96-97
    5.4.2 乙醇生成动力学模型的构建  97-98
    5.4.3 还原糖消耗动力学模型的构建  98-99
  5.5 本章小结  99-100
第六章发酵后纤维组份的回收及残渣利用初探  100-105
  6.1 实验材料及测定方法  100-101
    6.1.1 实验材料  100
    6.1.2 实验试剂及仪器  100
    6.1.3 分析方法  100-101
  6.2 发酵后组分回收研究  101
    6.2.1 木质素的回收  101
    6.2.2 碱溶性半纤维素糖类的回收  101
    6.2.3 结果与讨论  101
  6.3 发酵后纤维废料的综合利用初探  101-104
    6.3.1 黑麦草粉发酵乙醇的回用闭路循环  102-103
    6.3.2 木质素利用初探  103-104
    6.3.3 木质纤维素制作活性炭初探  104
  6.4 本章小结  104-105
第七章结论与展望  105-108
  7.1 结论  105-106
  7.2 展望及建议  106-108
参考文献  108-117
攻读学位期间的主要学术成果  117-118
致谢  118

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