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益气活血药对心梗大鼠心室重构及其TGF-β1/Notch信号通路影响的研究

作　者: 杨丹丹
导　师: 郭书文
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西结合基础
关键词: 心梗心室重构益气活血信号通路
分类号: R259
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：心肌梗死(myocardial infarction, MI)后心室重构(ventricular remodeling, VR)指MI后多种神经内分泌调节系统和细胞内相关信号转导机制被激活,引起心肌细胞、非心肌细胞、细胞外间质变化,使心脏的结构和功能改变的过程。主要表现为梗死区室壁变薄,心肌细胞坏死、纤维化；非梗死区心肌细胞代偿性肥大、心肌细胞凋亡、细胞外基质改变,进一步可引起右心室重构,最终导致心脏形态结构和功能异常,发展为心力衰竭(heart failure, HF)。心肌梗死后,RAAS被激活,细胞外基质增加,基质金属蛋白酶(MMPs)和组织金属蛋白抑制酶(TIMPs)之间平衡被打破。TGF-β1是一种强效的致纤维化因子,在心肌纤维化时表达增加,是目前抗纤维化治疗的主要标靶之一。在心肌损伤修复过程中,TGF-β1/Smads信号通路被激活,调节炎症反应和纤维化反应,参与结构性心室重构过程。Notch信号通路首先在果蝇体内发现,在无脊椎动物和脊椎动物中广泛存在,且高度保守,其作用途径是通过局部细胞间相互作用而产生,参与细胞分化、凋亡,Notch信号蛋白过表达或缺乏均可造成心脏发育异常。研究表明Notch信号在重构中有重要作用,Notch1在TGF-β1诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中表达降低。那么在心室重构过程中,Notch信号表达情况以及与TGF-β1之间的联系,需进一步研究。目的：基于心肌梗死动物模型,以气血理论为指导,利用前期实验效果最显著的益气活血药2：1组进行干预,采用超声心动检测、免疫组化技术,从心脏结构、功能以及微血管方面探讨心肌梗死大鼠心室重构的形成及益气活血药对其影响；同时从分子生物学角度,探讨TGF-β1、Notch相关基因和蛋白在重构中的表达以及益气活血药对其作用；利用生物信息学方法对益气活血药作用进行分析,进一步揭示益气活血药作用的分子机制。方法：1.通过左冠状动脉结扎术构建急性心肌梗死动物模型,手术后随机分为模型组、益气活血组、通心络组、培哚普利组,加上假手术组,以术后7天、术后28天两个时间点进行观察,共十组。手术第二天开始给药,术后第5天进行心电图检测,最后在各时间点分别取材。2.利用超声检测7天、28天各时间点大鼠心脏功能,运用免疫组化法检测微血管表达情况,HE病理染色、Masson染色观察梗死区和非梗死区组间结构、胶原表达情况,利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)方法检测MMP2基因和蛋白表达情况,综合评价心肌梗死大鼠心室重构的形成及益气活血药对其影响。3.利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测7天、28天各时间点大鼠心脏组织TGF-β1、 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、RBPJ、Hes-1基因表达情况,利用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)方法检测TGF-β1、Notch1、Notch3、Notch4、Hes-1蛋白表达情况,探讨TGF-β1分子及Notch信号在梗死后心室重构大鼠心肌组织表达情况以及益气活血药对其影响,通过相关性分析,揭示在重构中TGF-β1和Hes-1关系。结果：1.各组超声检测结果比较7天、28天各时间点模型组大鼠舒张期左室内径(LVDd)、收缩期左室内径(LVDs)较假手术组增高,差异有显著性(P<0.05),给药干预后给药组LVDs较模型组显著降低(P<0.05)；模型组左室短轴率(FS)、左室射血分数(EF)较假手术组降低,差异有显著性(P<0.05);Masson染色显示各时间点模型组胶原表达较假手术组明显增加,给药干预后胶原表达有下降趋势；微血管计数(MVC)结果显示各时间点模型组微血管数量较假手术组增加(P<0.05),给药干预后与模型组比较,MVC表达增加,并且28天作用显著(P<0.05);MMP2基因和蛋白结果显示各时间点模型组表达较假手术组增加(P<0.05),给药干预后基因表达降低,并且7天时间点差异显著(P<0.05)。2.实时荧光定量PCR结果显示模型组大鼠术后TGF-β1,Notch1、Notch3、Hes-1基因表达较假手术组增加,给药干预后基因表达有下降趋势,其中Notch1、Notch3、Hes-1在7天时间的差异显著(P<0.05),TGF-β1基因和蛋白表达在7天、28天差异均显著(P<0.05),给药干预后Notch1、Hes-1蛋白表达在7天、28天时间点均有降低趋势,Notch1蛋白表达在7天时间点显著降低(P<0.05),Hes-1蛋白表达在28天差异显著(P<0.05)；根据相关性分析TGF-β1与Hes-1蛋白在心梗后大鼠心肌存在明显相关性(R2=0.968,P<0.05)。结论：1.益气活血药对心梗后大鼠心脏结构、心脏功能、细胞外基质有较好调节作用,通过改善心功能、减小心肌细胞肥大,促进微血管新生来改善心室重构。2.益气活血药通过抑制TGF-β1产生抗纤维化作用,进而提高EF,改善心室重构,通过抑制Notch1、Notch3、Hes-1对心肌细胞分化产生影响,从而改善心室重构,并且Notch信号和TGF-β1信号之间有相关性。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
英文缩略词表  10-11
第一部分文献综述  11-23
  综述一心肌梗死后心室重构研究概况  11-18
    1 中医对心肌梗死心室重构病名的认识  11-12
    2 现代医学对心室重构认识  12-15
    3 展望  15-16
    参考文献  16-18
  综述二心室重构有关信号通路的研究  18-23
    1 Rho信号通路  18
    2 Wnt-Frizzled信号通路  18-19
    3 TGF-β/Smad信号通路  19
    4 Notch信号通路  19-21
    参考文献  21-23
第二部分实验研究  23-64
  实验一心肌梗死大鼠心室重构的形成及益气活血药对其影响的研究  23-48
    前言  23-24
    材料与方法  24-34
    实验结果  34-44
    讨论  44-46
    参考文献  46-48
  实验二益气活血药对心梗后大鼠TGF-β/NOTCH信号通路的影响  48-64
    前言  48
    材料与方法  48-51
    实验结果  51-61
    讨论  61-63
    参考文献  63-64
结论  64-65
附图1 各组大鼠心电图检测  65-67
附图2 各组大鼠超声心动观察  67-68
附图3 心脏取材图  68-69
附图4 各组大鼠心肌HE病理染色(10X40)  69-70
附图5 各组大鼠心肌非梗死区微血管观察(10X10)  70-71
附图6 各组大鼠心肌MASSON染色  71-74
附图7 ICH  74-78
  TGFB-1 ICH(10X40)  74-75
  Notch 1 ICH( 10X40)  75-76
  Notch3 ICH( 10X40)  76-77
  Hes-1 ICH( 10X40)  77-78
致谢  78-79
个人简历  79

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