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栉江珧精子的超低温冷冻保存及精子质量检测方法的研究

作　者: 郑娇
导　师: 余祥勇
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 栉江珧精子超低温冷冻质膜完整性线粒体活性
分类号: S968.316.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文以栉江珧为研究对象，以二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)、蔗糖为抗冻剂，对栉江珧精液进行超低温冷冻保存，尝试建立栉江珧精子的超低温冷冻保存的基本程序；并选用荧光染料对栉江珧精液进行染色来检测精子质膜完整性、线粒体活性，筛选出适宜栉江珧精子质量检测的染色方法，为贝类精子质量检测提供参考数据。1栉江珧精子超低温冷冻保存的研究本文利用解剖法采集栉江珧精液，以自然海水为基础液，配置不同浓度的二甲基亚砜、甘油、蔗糖作为超低温保护剂，于成熟的精子中加入不同种类、不同浓度的抗冻剂，样品按照四组不同的降温程序平衡后投入液氮中保存，比较其超低温冷冻保存的效果。并且还探讨了不同浓度的DMSO、样品保存体积、平衡时间、解冻方式对栉江珧精液冷冻效果的影响。结果表明：抗冻保护剂DMSO其冷冻保存效果优于甘油、DMSO与蔗糖混合的效果，二甲基亚砜浓度过高或过低都会影响存活率，其最适浓度为8%~10%；样品保存的最适体积为1.0~1.5mL；在0℃平衡处理，15min时保存效果较好；解冻方式采取38~40℃水浴快速解冻效果较好。2双荧光复染法检测栉江珧精子质膜完整性研究本文采用二乙酰荧光素（FDA）和碘化丙啶（PI）两种荧光染料对栉江珧精子质膜完整性进行检测，比较不同的染色浓度和时间的效果，筛选出FDA和PI的最适染色浓度均为10μg/mL，染色时间为10min。用水浴致死的精液和新鲜精液配置含有不同死亡率的9个样品（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%），将其作为理论死亡率，采用PI和FDA检测各个样品的实际死亡率，并进行相关性分析。结果表明FDA和PI能有效区分活精子和死精子，活精子发出绿色荧光，死精子发出红色荧光，各样品理论死亡率和实测精子死亡率之间呈极显著正相关，相关系数R=0.99(P<0.01)，表明FDA-PI双荧光复染法检测精子质膜完整性是可行的。用此方法检测栉江珧精液超低温冷冻前后的质膜完整率，结果表明栉江珧精液经超低温冷冻保存后其存活率显著下降（P<0.01），质膜也受到了不同程度的损伤。3罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）检测栉江珧精子线粒体活性研究本文采用罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）两种荧光染料对栉江珧精子线粒体活性进行检测，比较不同染液浓度和染色时间的检测效果，并用该方法检测和比较超低温冷冻保存对线粒体活性的影响。结果显示：Rh123染色的最适染液浓度为10μg/mL，染色时间控制在10min之内；染色后具有线粒体活性的精子发出绿色荧光，死精子发出红色荧光，质膜受损但线粒体还未受损的精子发出红绿色荧光，表明Rh123和PI双荧光染色检测栉江珧精子线粒体活性是可行的；精液经冷冻后，线粒体活性为61.9%、质膜完整率56.8%，显著低于新鲜精液组（95.3%、93.5%），表明冷冻对精子结构会造成不同程度的损伤，Rh123和PI双荧光染色法可用来检测栉江珧精子质量。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-12
1 引言  12-22
  1.1 海产动物精子超低温保存概况  12-16
    1.1.2 精子低温保存原理  12
    1.1.3 精子低温保存发展史  12-13
    1.1.4 抗冻保护剂  13-14
    1.1.5 冷冻  14-15
    1.1.6 解冻  15
    1.1.7 冷冻技术在海产贝类中的应用前景  15-16
  1.2 精液质量检测方法进展  16-19
    1.2.1 常规染色法  16-17
    1.2.2 低渗肿胀试验  17
    1.2.3 荧光染色技术  17-19
  1.4 栉江珧研究概况  19-20
  1.5 本文研究意义及研究内容  20-22
    1.5.1 研究意义  20
    1.5.2 研究内容  20-22
2 栉江珧精子的超低温冷冻保存研究  22-31
  2.1 材料与方法  22-23
    2.1.1 试验材料  22
    2.1.2 实验试剂及仪器  22
    2.1.3 方法  22-23
  2.2 结果与分析  23-28
    2.2.1 栉江珧精子在不同抗冻液和降温程序条件下的超低温保存效果  23-24
    2.2.2 冷冻样品中不同 DMSO 浓度对精子质膜完整性的影响  24-25
    2.2.3 不同平衡时间对精子保存效果的影响  25-26
    2.2.4 样品体积对精子保存效果的影响  26-27
    2.2.5 解冻方式对精子保存效果的影响  27
    2.2.6 不同超低温保存时间复苏效果比较  27-28
  2.3 讨论  28-31
    2.3.1 不同抗冻保护剂及浓度对精子保存效果的影响  28-29
    2.3.2 不同降温速度对精子保存效果的影响  29
    2.3.3 不同平衡时间对精子保存效果的影响  29
    2.3.4 不同样品体积对精子保存效果的影响  29-30
    2.3.5 不同解冻方式对精子保存效果的影响  30-31
3 双荧光复染法检测栉江珧精子质膜完整性的研究  31-39
  3.1 材料与方法  31-32
    3.1.1 精子的获得及样品的制备  31
    3.1.2 实验试剂及仪器  31-32
    3.1.3 不同染料浓度和染色时间下精子死亡率的比较  32
    3.1.4 双荧光复染法检测理论死亡率和实测死亡率的相关性  32
    3.1.5 双荧光染色法检测冷冻前后精子质膜完整率  32
    3.1.6 统计学分析  32
  3.2 结果与分析  32-36
    3.2.1 PI 和 FDA 的荧光染色结果观察  32-33
    3.2.2 FDA 和 PI 最适染色浓度和时间的确定  33-34
    3.2.3 理论死亡率和实测死亡率相关性比较  34-35
    3.2.4 双荧光复染法检测冷冻前后精子质膜完整率  35-36
  3.3 讨论  36-39
    3.3.1 精子质膜完整性检测  36-37
    3.3.2 PI 和 FDA 荧光染色  37
    3.3.3 冷冻对精子质膜完整性的影响  37-39
4 栉江珧(Atrina pectinata)精子线粒体活性的荧光检测  39-44
  4.1 材料与方法  39-40
    4.1.1 精子的获取与样品的制备  39
    4.1.2 实验试剂及仪器  39
    4.1.3 不同染料浓度和染色时间条件下精子线粒体活性的检测  39
    4.1.4 双荧光复染法检测冷冻前后精子线粒体活性  39-40
    4.1.5 统计学分析  40
  4.2 结果与分析  40-42
    4.2.1 Rh123 和 PI 染色结果观察  40-41
    4.2.2 Rh123 适宜染色浓度及时间的确定  41
    4.2.3 冷冻前后精子的线粒体活性  41-42
  4.3 讨论  42-44
    4.3.1 精子线粒体活性检测  42
    4.3.2 冷冻对精子线粒体活性的影响  42-44
5 结论  44-45
参考文献  45-53
致谢  53-54
作者简介  54-55
导师简介  55

栉江珧精子的超低温冷冻保存及精子质量检测方法的研究

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