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热应激对三个品系锦鲤非特异性免疫及HSP70基因表达的影响

作　者: 张崇英
导　师: 李云; 罗琳
学　校: 西南大学
专　业: 水产养殖
关键词: 热应激锦鲤非特异性免疫指标HSP70
分类号: S965.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

为研究各品系锦鲤的抗逆机理、相互间的抗逆差别,本试验以红白锦鲤、昭和锦鲤、黄金锦鲤为研究对象,探讨持续热应激下三个品系锦鲤非特异性免疫指标和HSP70基因的表达量的变化。试验按3.5℃/h的速度将水温从25℃升至32℃(升温时间为2h),在32℃条件下持续应激24h。分别于应激前、应激后0、4、8、12、16、20、24h取样,测定血浆补体蛋白3(C3)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、碱性磷酸酶(AKP)、髓过氧化物酶(MPO)、全血呼吸爆发以及心脏组织HSP70基因的相对表达量。结果如下：(1)热应激下三个品系锦鲤全血呼吸爆发与应激前相比均没有显著性的差异(P>0.05),应激前与应激后的整个过程中,昭和锦鲤和红白锦鲤呼吸爆发活力显著性高于黄金锦鲤(P<0.05)。(2)热应激下黄金锦鲤和红白锦鲤血浆C3含量增加,应激12-24h血浆C3的浓度显著性地高于应激前的水平(P<0.05)。热应激下昭和锦鲤血浆C3含量降低,应激8-20h显著性低于应激前的水平(P<0.05)。应激前昭和锦鲤血浆C3含量显著性高于红白锦鲤和黄金锦鲤(P<0.05),而应激结束时昭和锦鲤血浆C3显著性低于黄金锦鲤(P<0.05),低于红白锦鲤(P>0.05)。(3)热应激后在个品系锦鲤血浆SOD活力均没有显著性的差异(P>0.05)。热应激前后的整个实验过程中,黄金锦鲤血浆SOD活力显著性高于红白锦鲤和昭和锦鲤(P<0.05)。(4)热应激下,黄金锦鲤血浆MDA含量总体呈下降趋势,应激8-24h黄金锦鲤血浆MDA显著性低于应激前的水平(P<0.05)。红白锦鲤血浆MDA含量先上升后降低,应激16h时显著高于应激前的水平(P<0.05)。热应激后昭和锦鲤血浆MDA呈上升趋势,应激0、8、16-24h时显著性高于应激前的水平(P<0.05)。应激前,黄金锦鲤血浆MDA显著性高于红白锦鲤和昭和锦鲤,而在应激结束时昭和锦鲤血浆MDA显著性高于红白和黄金锦鲤(P<0.05)。(5)应激后黄金锦鲤和红白锦鲤血浆AKP均高于应激前的水平,应激后8-24h黄金锦鲤显著性的高于应激前的水平(P<0.05),应激后12-16h红白锦鲤显著性的高于应激前的水平(P<0.05)。应激后昭和锦鲤血浆AKP均低于应激前的水平,应激后20h显著性低于应激前的水平(P<0.05)。应激前和应激后0-4h,血浆AKP大小为昭和锦鲤>红白锦鲤>黄金锦鲤,应激后8-24h血浆AKP大小为红白锦鲤>昭和锦鲫>黄金锦鲤。(6)热应激后黄金锦鲤和红白锦鲤血浆MPO与应激前的水平相比均无显著性的变化(P>0.05)。应激后昭和锦鲤血浆MPO的水平均高于应激前的水平,应激后12、20-24h显著性高于应激前的水平(P<0.05)。在整个实验过程中,黄金锦鲤血浆MPO活性均低于昭和锦鲤和红白锦鲤,除了应激后4h和8h。(7)热应激后,在个品系锦鲤HSP70mRNA的表达量具有相似的变化趋势。应激Oh时HSP70mRNA的表达量显著性上升(P<0.05),并且达到整个过程的峰值,黄金锦鲤、红白锦鲤、昭和锦鲤的表达量分别提高到应激前的78.7、27.8和9.9倍。应激4-16h,HSP70mRNA的表达量恢复到应激前的水平,应激20h时,HSP70mRNA的表达量再次升高。在在个品系锦鲤之间,应激后0、20h,HSP70mRNA的相对表达量为黄金锦鲤>红白锦鲤>昭和锦鲤；应激后24h为红白锦鲤>黄金锦鲤>昭和锦鲤,其他时间三个品系间无显著性差异。结果表明：热应激下三个品系锦鲤非特异性免疫指标和HSP70mRNA表达呈现不同的变化。热应激显著性地诱导了三个品系锦鲤HSP70mRNA的表达,诱导了黄金锦鲤和红白锦鲤血浆补体C3和AKP的合成,以及昭和锦鲤MPO的合成。结合实际生产中三个品系锦鲤抗病抗逆差异,我们可以推断热应激下诱导合成的HSP70、C3、AKP和MPO可能在机体抗逆过程中发挥着重要的作用。为进一步研究HSP70在鱼类抗应激反应中的作用机理,本研究采用5’RACR和3’RACE的方法克隆了锦鲤HSP70基因的全长序列,该序列长度为2289bp,编码643个氨基酸。HSP70蛋白预测分子质量为70.46kD,理论等电点为5.47,整个蛋白带负电荷,在溶液中性质稳定。氨基酸序列分析显示,锦鲤HSP70具有HSP70家族的3个签名序列,以及HSP70家族细胞质特征基序EEVD和靠近C端的1个四肽序列GGMP。同源性分析发现锦鲤HSP70与其他生物的HSP70序列具有较高的同源性,与草鱼HSP70氨基酸序列相似性最高达97.67%,与无脊椎动物果蝇的相似性都高达73.04%。锦鲤HSP70蛋白无明显跨膜区域,无信号肽,是一种非跨膜、非分泌型蛋白。HSP70是亲水性蛋白,具有较多的抗原表位,潜在的抗原表位有27个。二级结构预测,显示该蛋白主要以a-螺旋和无规卷曲为主,含少量的β-折叠,间或有B-转角。通过同源模建,获得了锦鲤HSP70三维结构预测图。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章文献综述及研究的目的和意义  11-23
  1.1 锦鲤概况  11-13
    1.1.1 锦鲤的生物学特性  11
    1.1.2 锦鲤的养殖概况  11
    1.1.3 锦鲤的品种分类及特征  11-13
  1.2 鱼类非特异性免疫  13-18
    1.2.1 鱼类非特异性免疫相关的组织和器官  13
    1.2.2 鱼类非特异性体液免疫因子  13-17
    1.2.3 鱼类非特异性免疫细胞  17-18
    1.2.4 影响鱼类非特异性免疫的因素  18
  1.3 HSP70研究概况  18-21
    1.3.1 HSP70基因的表达调控机制  19
    1.3.2 HSP70的功能  19-21
  1.4 鱼类HSP70研究概况  21-22
    1.4.1 鱼类HSP70基因的克隆  21
    1.4.2 鱼类HSP70基因的表达  21-22
    1.4.3 鱼类HSP70的应用  22
  1.5 研究的目的和意义  22-23
第二章热应激对三个品系锦鲤非特性免疫指标以及HSP70基因表达的影响  23-43
  2.1 材料与方法  23-30
    2.1.1 实验材料  23
    2.1.2 热应激处理及取样  23
    2.1.3 主要仪器设备  23-24
    2.1.4 主要实验试剂  24
    2.1.5 非特异性免疫指标的测定  24-27
    2.1.6 荧光定量PCR检测HSP70 mRNA表达水平  27-29
    2.1.7 数据处理  29-30
  2.2 结果与分析  30-38
    2.2.1 热应激对血细胞呼吸爆发的影响  30
    2.2.2 热应激对血浆C3的影响  30-31
    2.2.3 热应激对血浆SOD的影响  31-32
    2.2.4 热应激对血浆MDA的影响  32-33
    2.2.5 热应激对血浆AKP的影响  33-34
    2.2.6 热应激对血浆MPO的影响  34-35
    2.2.7 热应激对锦鲤心脏组织HSP70基因表达的影响  35-38
  2.3 讨论  38-42
  2.4 结论  42-43
第三章锦鲤HSP70 cDNA的克隆  43-61
  3.1 材料与方法  43-48
    3.1.1 实验材料  43
    3.1.2 主要仪器设备与试剂  43
    3.1.3 RNA提取  43
    3.1.4 5'RACE  43-47
    3.1.5 3'RACR  47-48
  3.2 结果与分析  48-58
    3.2.1 5'RACE和3'RACR电泳与测序结果  48-49
    3.2.2 基本理化性质分析  49-50
    3.2.3 氨基酸序列同源性比较  50-52
    3.2.4 蛋白质亲水性、柔韧性及抗原性分析  52-54
    3.2.5 跨膜区结构预测  54
    3.2.6 卷曲螺旋预测  54-55
    3.2.7 信号位点分析  55-56
    3.2.8 锦鲤HSP70二级结构预测  56-57
    3.2.9 锦鲤HSP70三维结构预测  57-58
  3.3 讨论  58-61
参考文献  61-67
致谢  67-69
发表文章  69
参与的项目  69

热应激对三个品系锦鲤非特异性免疫及HSP70基因表达的影响

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