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牛初乳中免疫球蛋白A的分离纯化

作　者: 章飞燕
导　师: 任其龙
学　校: 浙江大学
专　业: 应用化学
关键词: 牛初乳免疫球蛋白阴离子交换层析凝胶过滤层析强碱树脂
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

牛初乳中含有比常乳高10～100倍的IgG、sIgA和IgM。其中的sIgA与母乳中的sIgA具有免疫同源性,具有抗菌、抗炎和抗病毒等生物活性功能,因此开发利用牛初乳中的sIgA具有十分重要的现实意义。离心脱脂后得到的牛初乳乳清经过40%的硫酸铵沉淀,获得的盐析产品主要含有三种免疫球蛋白,分别是IgG、sIgA和IgM。本文主要研究了从此盐析样品中分离纯化得到免疫球蛋白A的方法与工艺。包括阴离子交换柱层析分离获得免疫球蛋白A和免疫球蛋白M (sIgA+IgM)粗产品,凝胶柱层析进一步分离获得免疫球蛋白A这两个主要过程。经脱脂、盐析后得到的牛初乳原料样品中主要含有IgG、sIgA和IgM,其中IgG的含量约为81～84%,sIgA+IgM的含量约为16～19%。首先,以阴离子交换柱层析对三种免疫球蛋白进行初步分离,除去大部分的免疫球蛋白G,获得sIgA+IgM的粗产品(含有少量IgG)。利用穿透曲线实验考察了DEAE-650M阴离子交换吸附剂对不同的免疫球蛋白分离纯化的能力,并讨论了缓冲液pH和离子强度对其分离纯化能力的影响。在40.2 mL的DEAE-650M阴离子交换层析柱中,当上样浓度为50 mg/mL,上样量为1.24mg/mLDEAE-650M阴离子交换介质,磷酸盐缓冲液离子强度为0.15 M,pH为7.3时,免疫球蛋白的分离效果最好,在此条件下通过层析实验可获得纯度为56.69%的sIgA+IgM粗产品,而且不同的免疫球蛋白在DEAE-650M阴离子交换介质中的动态吸附量随着缓冲液离子强度的增大而减小。通过层析实验,考察了强碱3#树脂对不同的免疫球蛋白分离纯化的能力,并讨论了不同缓冲液体系及缓冲液的pH和离子强度对其分离能力的影响。在32.8 mL的强碱3#树脂层析柱中,当上样量为1.52 mg/mL强碱3#树脂,上样浓度为50 mg/mL时,免疫球蛋白在磷酸盐缓冲液中的分离效果要优于tris-HCl缓冲液中的分离效果。优化后的工艺条件为离子强度0.03 M,pH7.0的磷酸盐缓冲液,在此条件下可获得纯度为91.24%,回收率为47.00%的sIgA+IgM粗产品。将在最优条件下,从强碱3#树脂层析柱中分离获得的slgA+IgM粗产品溶液在去离子水中透析脱盐后,冷冻干燥,平均1 mL sIgA+IgM粗产品溶液可获得0.0010 g粉末样品。将冻干后的粉末样品用0.03 M,pH 7.0的磷酸盐缓冲液重新溶解,配制成浓度为10 mg/mL的上样溶液,在36.8 mL的HW-55F凝胶层析柱中,上样量为1.35mg/mLHW-55F凝胶,磷酸盐缓冲液离子强度为0.03 M,pH为7.0的条件下,可以使sIgA与IgM得到有效的分离,获得sIgA产品的纯度可能已达到96.88%左右。

全文目录

致谢  5-6
前言  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
目录  11-15
1 文献综述  15-33
  1.1 牛初乳的研究进展  15-16
  1.2 牛初乳中的生物活性物质  16-22
    1.2.1 牛初乳中的乳铁蛋白(Lf)  16-17
      1.2.1.1 乳铁蛋白的生物学功能  16-17
      1.2.1.2 乳铁蛋白的应用  17
    1.2.2 牛初乳中的胰岛素样生长因子(IGF)  17-18
      1.2.2.1 IGF-I的生物学功能  17-18
      1.2.2.2 IGF-I的应用  18
    1.2.3 牛初乳中的多种酶类  18-19
      1.2.3.1 溶菌酶(LZ)  18
      1.2.3.2 乳过氧化物酶(LP)  18-19
      1.2.3.3 淀粉酶(AM)  19
      1.2.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)  19
      1.2.3.5 γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)  19
      1.2.3.6 乳酸脱氢酶(LDH)  19
    1.2.4 牛初乳中的免疫球蛋白(Ig)  19-22
      1.2.4.1 免疫球蛋白的结构  19-21
      1.2.4.2 免疫球蛋白的分类  21-22
  1.3 牛初乳中的IgG  22-24
    1.3.1 IgG的纯化分离  22-23
      1.3.1.1 IgG的粗提  22
      1.3.1.2 IgG的纯化  22-23
    1.3.2 IgG的检测  23-24
  1.4 牛初乳中的sIgA  24-31
    1.4.1 牛初乳sIgA的基本性质  24-25
    1.4.2 牛初乳sIgA的生物学功能  25-26
    1.4.3 牛初乳sIgA的分离纯化  26-28
      1.4.3.1 sIgA的粗提  26
      1.4.3.2 sIgA的纯化  26-28
        (1) 层析法(Chromatography)  26-27
        (2) 超滤法(Uultrafiltration)  27
        (3) 酶解法  27-28
    1.4.4 牛初乳sIgA的检测方法  28-31
      1.4.4.1 牛初乳sIgA的纯度检测  28-29
      1.4.4.2 牛初乳sIgA的活度鉴定  29-31
    1.4.5 牛初乳sIgA的应用前景  31
      1.4.5.1 调节免疫系统的应用  31
      1.4.5.2 调节胃肠道免疫功能的应用  31
  1.5 研究内容  31-33
    1.5.1 牛初乳样品中免疫球蛋白在阴离子交换柱层析中的分离工艺  31-32
    1.5.2 sIgA+IgM的进一步分离  32-33
2 牛初乳免疫球蛋白在DEAE-650M阴离子交换层析柱中的分离工艺  33-46
  2.1 仪器与材料  33-34
    2.1.1 仪器  33
    2.1.2 试剂与材料  33-34
  2.2 实验方法  34-37
    2.2.1 牛初乳样品中蛋白组成的分析  34-35
      2.2.1.1 流动相的配制  34
      2.2.1.2 色谱条件  34
      2.2.1.3 梯度洗脱  34-35
      2.2.1.4 免疫球蛋白浓度与HPLC峰面积的关系  35
    2.2.2 牛初乳免疫球蛋白在DEAE-650M阴离子交换层析柱中的分离  35-37
      2.2.2.1 穿透曲线实验  36
      2.2.2.2 层析实验  36-37
  2.3 实验结果与讨论  37-45
    2.3.1 牛初乳样品在HPLC上的分析结果  37-38
    2.3.2 免疫球蛋白浓度与HPLC峰面积的关系  38-39
    2.3.3 离子强度的影响  39-41
    2.3.4 缓冲液pH的影响  41-42
    2.3.5 牛初乳免疫球蛋白的层析分离  42-45
  2.4 本章小结  45-46
3 牛初乳免疫球蛋白在强碱3#树脂层析柱中的分离工艺  46-62
  3.1 仪器与材料  46-47
    3.1.1 仪器  46
    3.1.2 试剂与材料  46-47
  3.2 实验方法  47-50
    3.2.1 牛初乳免疫球蛋白在强碱3#树脂层析柱中的分离  47-48
    3.2.2 牛初乳免疫球蛋白在强碱3#树脂层析柱中的吸附穿透曲线  48
    3.2.3 组分B的浓缩  48
    3.2.4 非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  48-50
      3.2.4.1 蛋白质样品制备  48
      3.2.4.2 凝胶板的制备  48-49
      3.2.4.3 点样  49
      3.2.4.4 电泳  49
      3.2.4.5 拨胶、染色、脱色  49-50
  3.3 实验结果与讨论  50-60
    3.3.1 牛初乳免疫球蛋白在磷酸盐缓冲液体系中的分离  50-57
      3.3.1.1 pH值的影响  50-51
      3.3.1.2 离子强度的影响  51-52
      3.3.1.3 牛初乳免疫球蛋白在磷酸盐缓冲液中的层析分离  52-56
      3.3.1.4 牛初乳免疫球蛋白在磷酸盐缓冲液体系中的穿透曲线  56-57
    3.3.2 牛初乳免疫球蛋白在tris-HCl缓冲液体系中的分离  57-60
      3.3.2.1 pH值和离子强度的影响  57-58
      3.3.2.2 牛初乳免疫球蛋白在tris-HCl缓冲液中的层析分离  58-60
  3.4 本章小结  60-62
4 sIgA和IgM的进一步分离  62-68
  4.1 仪器与材料  62
    4.1.1 仪器  62
    4.1.2 试剂与材料  62
  4.2 实验方法  62-64
    4.2.1 sIgA+IgM粗产品溶液的透析脱盐  62-63
    4.2.2 sIgA+IgM粗产品脱盐溶液的冷冻干燥  63
    4.2.3 冻干样品中的免疫球蛋白在HW-55F凝胶色谱中的分离  63-64
  4.3 结果与讨论  64-67
    4.3.1 sIgA+IgM粗产品溶液的透析脱盐  64
    4.3.2 sIgA+IgM粗产品脱盐溶液的冷冻干燥  64-65
    4.3.3 冻干样品中的免疫球蛋白在HW-55F凝胶色谱中的分离  65-67
  4.4 本章小结  67-68
5 结论与展望  68-70
  5.1 结论  68-69
  5.2 展望  69-70
参考文献  70-77
作者简历  77

牛初乳中免疫球蛋白A的分离纯化

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