学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

镉、铜分别胁迫虾夷扇贝的毒性作用机制研究

作　者: 孟晓林
导　师: 王雷
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 水产养殖
关键词: 虾夷扇贝镉铜蓄积规律抗氧化防御系统 RNA-Seq 差异表达基因
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）是我国北方重要的海水养殖贝类。随着近年来经济的高速发展，逐渐严重的海洋污染给虾夷扇贝养殖业造成了巨大的损失，尤其是生物毒素和持久有机污染物等蓄积引发的食品安全问题，严重制约了产业的健康可持续发展。但是，由于基因组信息资源的缺乏，对于各类海洋污染物，尤其是重金属对虾夷扇贝毒性作用机制的深入研究相对比较匮乏。本研究利用生物化学、分子生物学及生物信息学技术，分别研究了重金属镉（Cd）、铜（Cu）在虾夷扇贝鳃、消化腺组织内的蓄积规律；镉、铜对虾夷扇贝鳃、消化腺组织内SOD、CAT、GPx酶活性的影响；成体虾夷扇贝的全转录组测序及在镉、铜分别胁迫条件下，虾夷扇贝鳃、消化腺组织基因差异表达谱等。主要结果如下：1.研究了镉在虾夷扇贝鳃和消化腺两组织的累积规律，结果表明累积量与胁迫的剂量呈现出线性相关性，同时随着胁迫时间的延长，蓄积量表现出曲线变化规律。两组织中最大Cd蓄积分别出现在10d，0.20mg/L胁迫组（鳃，134.20μg/g）和14d，0.10mg/L胁迫组（消化腺，109.20μg/g）。鳃组织中镉的蓄积量要高于消化腺组织，其相对为虾夷扇贝镉的主要富集组织。2.研究了铜在虾夷扇贝鳃、消化腺两组织中的累积规律，结果表明，0.025mg/L胁迫组在鳃中最高累积出现在14d（347.55μg/g），0.05mg/L、0.10mg/L胁迫组最高累积均出现在6d，分别为340.72μg/g和302.30μg/g。除0.025mg/L胁迫组外，整体随时间呈曲线变化关系。消化腺组织中，0.10mg/L胁迫组铜累积随时间呈线性关系，最高累积出现在14（d60.88μg/g），而0.025mg/L与0.05mg/L组随暴露时间的延长均表现出曲线变化关系。分析表明，鳃是虾夷扇贝铜的主要蓄积部位。消化腺组织对铜的累积不存在浓度依赖性关系，对高铜胁迫累积反应较为敏感。3.研究了镉胁迫对虾夷扇贝两组织的主要抗氧化酶活性的影响。结果表明镉胁迫下鳃、消化腺组织内SOD、CAT、GPx活性基本呈现峰值分布。两组织中，0.10mg/L、0.20mg/L胁迫组SOD活性均在胁迫1d时达到最大值，而0.05mg/L胁迫组峰值均出现在3d。对CAT活性研究表明，鳃组织各胁迫浓度组变化趋势与SOD一致，而消化腺组织则随胁迫浓度增加，最高活性分别出现在10d、6d和1d。对GPx活性研究表明，鳃组织中随胁迫浓度升高，活性最高值分别出现在6d、3d和1d，消化腺组织则分别在3d和1d达到最高。SOD是镉胁迫下虾夷扇贝鳃组织内的主要抗氧化酶，而CAT是消化腺组织在镉胁迫条件下的主要抗氧化酶。4.研究了不同铜胁迫浓度对虾夷扇贝两种组织的主要抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性的影响。结果显示，鳃组织各抗氧化酶在胁迫期内均被显著性抑制。消化腺组织中，除0.05mg/L胁迫组对GPx酶活性24h时显著抑制外，0.025mg/L、0.05mg/L胁迫浓度在24h内均可诱导抗氧化酶显著表达，但随胁迫期的延长逐渐降低。0.10mg/L胁迫组各酶活性在胁迫期内显著性抑制。与镉对虾夷扇贝的毒性相比，铜的毒性作用更强，对虾夷扇贝抗氧化防御系统的破坏性更大。5.通过RNA-Seq技术，对成体虾夷扇贝鳃、消化腺、性腺、闭壳肌、外套膜、肾脏及内脏团组织混合样本进行了全转录组分析，共产生194,839条非冗余读段，其中14,240条读段获得了明确功能注释。同时基于GO分析获得了721个与刺激反应（response to stimulus）相关的转录本。通过KEGG分析，获得了251个包含在13个免疫通路中的转录本。6.对虾夷扇贝镉胁迫条件下的鳃、消化腺组织进行差异表达基因研究。鳃组织中共确认了7,556个显著性差异表达基因，其中，3,673个基因上调，3,883个基因下调。消化腺组织中共发现3,002个差异表达基因，其中，上调基因1,627个，下调基因1,375个。通过代谢通路富集性分析确认了大量与环境胁迫相关的差异表达基因。7.对虾夷扇贝铜胁迫条件下的鳃、消化腺组织差异表达基因进行研究。鳃组织中共确认3,459个显著性差异表达基因，其中，1,312个基因上调，2,237个基因下调。消化腺组织中共确认1,718个差异表达基因，其中，上调基因841个，下调基因877个。通过GO富集性分析，发现了大量铜胁迫条件下与化学物质刺激反应相关的差异表达转录本。通过KEGG富集性分析，确认了许多虾夷扇贝在受到铜胁迫时免疫系统相关基因的表达变化情况。本研究初步了解了镉、铜对虾夷扇贝的分子毒性作用机制，将为进一步深入研究海洋污染物对虾夷扇贝的毒性作用机理奠定一定的理论基础。同时，虾夷扇贝的全转录组测序数据极大程度的丰富虾夷扇贝序列数据库，筛选得到的敏感差异表达基因可作为候选基因，构建虾夷扇贝养殖预警预报体系平台，以期为我国虾夷扇贝的健康、安全养殖提供一定的科学依据。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-8
ABSTRACT  8-17
第一章文献综述  17-45
  第一节虾夷扇贝及其养殖概况  17-18
    一、虾夷扇贝生物学习性  17
    二、国内外养殖概况  17-18
  第二节主要海洋污染物及其研究进展  18-21
    一、重金属污染物  18-19
    二、持久性有机污染物  19-21
  第三节镉、铜对双壳类动物的毒作用机制  21-34
    一、镉、铜在双壳贝类的体组织累积规律  22-24
    二、镉、铜对双壳贝类的氧化损伤及抗氧化防御机制  24-30
      1. 氧化损伤  24-28
      2. 抗氧化防御系统  28-30
    三、镉、铜对双壳贝类免疫系统的作用  30-34
      1. 贝类免疫防御机制概述  30-33
      2. 镉、铜对贝类的免疫损伤研究  33-34
  第四节深度测序技术的研究现状及其应用  34-44
    一、新一代测序技术  34-38
      1. 测序技术的发展历史  34
      2. DNA测序技术原理及其比较  34-37
      3. 测序技术发展前景  37-38
    二、转录组测序技术及其在非模式生物研究中的应用  38-44
      1. 转录组分析技术平台  38-41
      2. 转录组分析（RNA-Seq）数据处理流程  41-43
      3. 转录组测序技术在非模式动物中的研究应用  43-44
  第五节本研究的目的及意义  44-45
第二章镉、铜在虾夷扇贝鳃、消化腺组织的累积规律  45-51
  第一节材料与方法  45-46
    一、实验材料及设备  45
    二、实验方法  45-46
      1. 养殖胁迫实验  45-46
      2. 镉、铜在虾夷扇贝鳃、消化腺组织中含量的测定  46
  第二节镉在虾夷扇贝鳃、消化腺组织的累积规律  46-48
    一、实验结果  46-47
    二、讨论与分析  47-48
  第三节铜在虾夷扇贝鳃、消化腺组织的累积规律  48-51
    一、实验结果  48-49
    二、讨论与分析  49-51
第三章镉、铜对虾夷扇贝抗氧化防御系统的影响  51-64
  第一节材料与方法  51-54
    一、实验材料与设备  51
    二、实验方法  51-54
      1. 胁迫实验方法  51
      2. 样品采集  51
      3. 总超氧化物歧化酶活力的测定  51-52
      4. 过氧化氢酶活力测定  52-53
      5. 谷胱甘肽过氧化物酶活力测定  53-54
      6. 数据统计分析  54
  第二节镉对虾夷扇贝抗氧化防御系统的影响  54-59
    一、实验结果  54-56
      1. 镉对虾夷扇贝鳃、消化腺SOD活性的影响  54
      2. 镉对虾夷扇贝鳃、消化腺CAT活性的影响  54-55
      3. 镉对虾夷扇贝鳃、消化腺GPx活性影响  55-56
    二、讨论与分析  56-59
  第三节铜对虾夷扇贝抗氧化防御系统的影响  59-64
    一、实验结果  59-62
      1. 铜对虾夷扇贝鳃、消化腺SOD活性的影响  59
      2. 铜对虾夷扇贝鳃、消化腺CAT活性的影响  59
      3. 铜对虾夷扇贝鳃、消化腺GPx活性的影响  59-62
    二、讨论与分析  62-64
第四章虾夷扇贝转录组测序  64-76
  第一节材料与方法  64-68
    一、主要化学试剂、溶液配方  64
    二、主要仪器设备  64
    三、实验方法  64-68
      1. 样本采集  64
      2. 总RNA提取  64-65
      3. 转录组测序及数据分析  65-68
  第二节结果与讨论  68-76
    一、双末端测序和读段的拼接  68-69
    二、预测蛋白基因注释  69-72
      1. GO注释  70
      2. KOG注释  70-71
      3. KEGG注释  71-72
    三、环境胁迫、免疫相关基因分析  72-76
第五章镉胁迫条件下虾夷扇贝鳃、消化腺基因表达谱分析  76-95
  第一节材料与方法  76-81
    一、实验材料及仪器设备  76
    二、表达谱测序及数据分析  76-79
      1. mRNA样本的纯化  76
      2. cDNA文库的构建  76
      3. 高通量测序  76-77
      4. 数据分析  77-79
    三、荧光实时定量PCR（Realtime-PCR）验证  79-81
  第二节结果与讨论  81-95
    一、测序数据分析  81
    二、镉胁迫条件下虾夷扇贝鳃、消化腺基因表达差异  81-84
    三、差异表达基因代谢通路富集性分析  84-94
    四、差异表达基因的RT-PCR验证  94-95
第六章铜胁迫条件下虾夷扇贝鳃、消化腺基因表达谱分析  95-119
  第一节材料与方法  95
    一、实验材料及主要设备  95
    二、表达谱测序及数据分析  95
    三、荧光实时定量PCR（Realtime-PCR）验证  95
  第二节结果与讨论  95-119
    一、测序数据分析  95-96
    二、铜胁迫条件下虾夷扇贝鳃、消化腺基因表达差异  96-98
    三、差异表达基因GO富集性分析  98-111
    四、差异表达基因信号通路富集分析及免疫相关基因表达  111-115
      1. 模式识别受体（PRRs）  113-114
      2. 细胞凋亡（Apoptosis）  114
      3. 溶酶体（lysosome）和C型凝集素（C-type lectin）  114-115
    五、差异表达基因的RT-PCR验证  115-119
主要结论、创新性及研究展望  119-121
参考文献  121-139
博士期间发表论文和专利情况  139

镉、铜分别胁迫虾夷扇贝的毒性作用机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文